測量熒光圖片的熒光強度，也是一個常用的操作，單熒光圖片直接測，多熒光通道merge圖片拆分一下通道也很方便。下面就熒光強度測量中常常會遇到的三種情況進行圖示：通道整體平均（加和）熒光強度、指定區域平均（加和）熒光強度以及大量細胞單獨的平均（加和）熒光強度，本質上其實還是在玩選區。

01 測量整體平均熒光強度

1、打開一張熒光圖片，并拆分成三個通道圖。具體見《利用Image J拆分和Merge熒光圖片》。

2、以藍色通道圖為例，選擇Image-Adjust-Threshold，勾選Dark Background，點擊Auto，結果将自動識别藍色的細胞核，并且以默認的紅色蒙版表示細胞核選區；

3、選擇Analyze-Set Measurements，勾選必須的測量選項：Mean gray value；Area和Integrated Density可以不勾選，這裡勾選；由于是利用threshold産生的紅色蒙版來确定測量的選區，所以Limited To Threshold必須勾選，否則是以整個圖片作為選區進行測定；由于有多張圖片在測量，把Display Label也勾選上，以示區别。

4、選擇Analyze-Measure（快捷鍵Ctrl M或M），獲得結果，結果Mean表示平均灰度值，IntDen表示總的灰度值；這個平均灰度值就可以用來表示圖片中的平均藍色熒光強度了，圖片裡面的細胞核越多，結果就會越準确。

同樣的方法可以測量綠色和紅色通道的熒光強度。

5、本教程前四步和之前有關測量的教程裡面，其實我們測的都是灰度值，這是軟件默認的表示方法。我們可以通過設置，測量真正的光密度值：選擇Analyze-Calibrate，選擇最下面一個Uncalibrated OD（未校正的OD值），會彈出Uncalibrated OD和pixel value（像素灰階值）的關系曲線。

我們從第4步獲得的結果可知，藍色通道圖片被threshold所選擇的細胞核像素灰度值是53-255，在上面這條曲線裡面，我們可以看到這個區間的灰階值和Uncalibrated OD是基本成線性關系的（事實上灰階值比較低的像素點是黑色的，被當成背景處理了），所以可以用Uncalibrated OD來表示細胞核的平均熒光強度。

6、選擇Analyze-Measure（快捷鍵Ctrl M或M），獲得結果，結果Mean為0.416，這就是平均的Uncalibrated OD，IntDen表示總的Uncalibrated OD；

02 少數區域的平均熒光強度

如果不想測量被Threshold所選擇的所有區域，比如我就對左下角這個完整的細胞核感興趣，我隻想測量它的平均熒光強度該怎麼辦呢？

很簡單，在用Threshold做出選區之後，使用其他選區工具對自己感興趣的區域進行再次選擇，然後測量就可以了。比如下圖，使用矩形工具在圖片上面拉一個框：

03 大量細胞各自的平均熒光強度

如果圖片中有多個熒光對象，我想測量每一個對象的平均熒光強度怎麼辦呢？很簡單，把每一個需要測量的對象都建立選區，然後分别對每個選區進行測量即可。

1、打開一張圖片，選擇Image-Type-8 bit（如果是如本教程拆分出來的單通道圖片，則不需要再轉成8 bit）；

2、選擇Image-Adjust-Threshold，勾選Dark Background，點擊Auto，利用threshold構建選區，選出需要測量的區域，這裡是細胞核。

3、因為有些細胞核連在一起了，需要用到二值化（Binary）裡面的“分水嶺”（Watershred）法來進行分割，所以這裡點擊Apply對紅色蒙版選區進行二值化；

4、選擇Process -> Binary -> Watershed，分割連在一起的細胞核；

5、選擇Analyze -> Analyze Particles，務必勾選“Add to Manager”，将這一步産生的選區添加到ROI管理器中。前面到這裡的五步和細胞自動計數是一樣的，唯一不同的地方就在于此，要勾選Add to Manager！

7、到此，獲得了所有細胞核的選區！勾選Show all，選擇File-Revert（或者關掉圖片重新打開一次），回到熒光照片最初的樣子，但是剛剛建立的幾百個選區仍然存在；

8、點擊ROI管理器上面的Measure，将獲得每個選區的測量結果，每個細胞核各自的平均熒光強度就測出來了。當然，在測量之前同樣可以轉換成Uncalibrated OD；

以上就是常見的熒光強度測量方式，有沒有幫到你呢？

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