近年來随着生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子标簽技術、mRNA差異顯示技術、基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法大多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點逐漸滿足不了科研的需求，因此，RACE技術應運而生，接下來，就讓小V帶大家去了解一下RACE技術吧!~

你在做實驗中還遇到過什麼問題？留言回複點贊最高的同學可獲得激光翻頁筆一支。

RACE 概念

RACE(rapid amplification of cDNA end)也叫cDNA末端快速擴增技術，是已知部分cDNA序列，基于逆轉錄和PCR快速克隆得到完整的cDNA的3'或5'末端的分子生物學技術。主要類型有3'RACE和5'RACE。

RACE 應用

RACE 原理

(Vazyme#RA101)

Cap-switching 5'RACE原理

逆轉錄模塊(Template-Switching)

第一鍊cDNA的合成

1.5' CDS Primer 識别RNA3'端poly A尾結構進行一鍊cDNA合成（若RNA無poly A尾，則可使用 5' Random Primer代替5'CDS Primer）；

2.逆轉錄進行到mRNA 5'端時，逆轉錄酶的末端轉移酶活性會在cDNA 3'末端加上d(C)；

3.5' TS Oligo接頭序列的3'末端帶有polyG，可與cDNA末端的d(C)序列結合；

4.逆轉錄酶繼續以5' TS Oligo為模闆合成cDNA，完成接頭轉化；

PCR模塊

cDNA末端的快速擴增

5.UP - Long 帶有通用引物序列和接頭序列，與第一鍊cDNA 的3'端結合，合成第二鍊 cDNA ；

6.5'GSP 引物以第二鍊cDNA為模闆合成第三鍊 cDNA；

7.UP - Short 為通用引物序列，與第三鍊 cDNA 的 3'端結合，合成互補雙鍊 DNA；

8.UP - Short 與 5'GSP 引物以雙鍊 DNA 為模闆進行 PCR擴增。

經典3'RACE原理

逆轉錄模塊

第一鍊cDNA的合成

1.3'CDS Primer 的5'端帶有一段接頭序列；

2.3'CDS Primer 識别 RNA 的3'端 poly A尾結構，逆轉錄合成一鍊cDNA（若RNA無poly A尾，則需進行加A處理）；

PCR模塊

cDNA末端的快速擴增

3.3'GSP 以第一鍊 cDNA 為模闆合成第二鍊 cDNA；

4.UP - Long 帶有與3'CDS Primer 相同的接頭序列，識别第二鍊cDNA的3'端，合成第三鍊 cDNA;

5.3'GSP 以第三鍊 cDNA 為模闆合成雙鍊 DNA;

6.3'GSP 與 UP - Short 以雙鍊 DNA為模闆進行PCR擴增。

RACE實驗流程及注意事項

引物設計的優劣對于做RACE是至關重要的，如果引物的特異性不好，就會給實驗帶來許多麻煩，甚至擴增不到我們實驗預想的目的産物，接下來小v就帶大家看看RACE實驗中需要用到的引物設計原則吧！

5'/3' GSP(基因特異性引物)設計原則 ：

引物長度：23 - 28個核苷酸，建議不超過30個核苷酸；GC含量：50% - 70%；

Tm值：Tm≥65°C，Tm>70°C使用Touch Down PCR有助于提高産物特異性；對于較長片段(>10 kb)或豐度較低的待測轉錄本，GSP引物設計盡量靠近cDNA的末端(≤3 kb)；針對同一待測轉錄本可設計多條GSP，進行RACE擴增以提高成功率。

NGSP(巢式基因特異性引物)設計原則（可選）：

1.引物長度、GC含量、Tm值：同GSP設計原則；位置：NGSP須設計在GSP的3'端，建議NGSP的5'末端與GSP的3'末端有5 - 15 nt的重疊，有助于提高二輪巢式擴增時的特異性。

2.如果上一輪 PCR 沒有理想的特異産物（如無擴增産物、産物較弱、産物彌散），或者産物非特異條帶過多、基因表達豐度低，巢氏PCR與RACE結合可以提高克隆的準确度，巢式引物結合在上一輪PCR産物的内部，進行PCR擴增可設計多輪巢式引物進行巢式PCR擴增。

友情提醒：巢式PCR可以提高擴增倍數，降低了非特異性反應連續放大進行的可能性，提高了實驗的成功率。

常見問題解答

1) 擴增較長片段有什麼建議？

➣ 建議擴增片段盡量不超過3 kb，靠近已知序列末端；

➣ 設置溫度梯度摸索最佳退火溫度；

➣ 檢測樣本RNA是否降解；

➣ 擴增較長片段時應該适當延長變性時間；

➣ GSP引物設計需要保證較好的特異性；

2) 進行cDNA末端快速擴增時沒有明顯産物條帶？

➣ RNA提取物中無目的轉錄本或者目的轉錄本表達豐度低，可以設計已知轉錄本區域的qPCR或PCR引物進行目的産物檢測；檢測後發現表達豐度低，可以增加RNA模闆投入量；

➣ RNA降解：進行試驗前檢測RNA的完整度，可以通過RNA瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整度；

➣ 設計Nested GSP，進行多輪巢式PCR（一般不超過3輪），富集産物片段同時保證了擴增産物特異性；

➣ 待擴增目的片段過長：提高PCR延伸時間，GSP設計時盡可能放在序列末端；

3) PCR出現明顯雜帶?

➣ 目的基因屬于多基因家族，可以進行數據庫對比，針對特異性區段序列設計GSP；

➣ 可能是RNA前體具有可變剪接形式，可以進行數據庫對比，針對特異性區段序列設計GSP;

➣ 擴增非特異性：設計額外的NGSP，進行多輪巢式PCR，将目的産物進行膠回收，再次進行RCP擴增。

4) 5' RACE成功，3' RACE失敗是什麼原因？3' RACE成功，5' RACE失敗是什麼原因？

➣ 如果5'RACE能做出來，3' RACE做不出來，大概率是GSP引物的問題；如果3'RACE成功，5' RACE失敗，可能與RNA完整度有關。

5) RNA不含poly A尾，加A處理後做了5' RACE 沒有出現目的條帶？

➣ 逆轉錄後設計已知序列的qPCR引物或PCR引物，擴增逆轉後的cDNA，如果沒有擴增說明沒有cDNA或含量較低，建議使用随機引物進行逆轉，同時選擇多條GSP進行PCR；如果有擴增産物，說明逆轉錄沒有問題，可以進行巢式PCR富集特異産物。

6) 引物設計結果為空白是什麼原因？

➣ 引物設計結果為空白，可能是沒有符合要求的引物序列，可以排查一下引物GC含量，GC含量太低或太高都會産生影響。

7) 5' RACE測序結果與軟件比對結果相比多出3個G堿基？

➣ 測序結果多出3個G堿基是RACE過程中加上去的，對實驗結果不會産生影響，軟件比對時把多出的堿基删除為真正的5'端序列。

8) 克隆産物測序結果不同，如何判斷哪個是全長序列？

➣ 轉錄本本身可能存在多種可變剪接形式，表明兩個序列都是正确的。盡量在實驗中盡可能地增加克隆數測序，減少實驗中的誤差。

好啦～，今天的知識點小v就介紹到這裡，如果在實驗過程中有什麼不懂的，可以随時來詢問小v，或者直接聯系身邊的諾唯贊人，我們将竭盡全力為大家提供優質的服務和可靠的産品。最後，希望大家做實驗都能做出完美的結果。

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