轉化(Transformation)是将外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體内并穩定地遺傳給後代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理後,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受态細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA分子通過複制,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。将經過轉化後的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)。

目前常用的感受态細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受态細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受态細胞暫時不用時,可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。

一. 材料

E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS質粒DNA:購買或實驗室自制，eppendorf管。

二. 試劑

1.LB固體和液體培養基：配方見第一章。

2.Amp母液：配方見第一章。

3.含Amp的LB固體培養基:将配好的LB固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪闆。

4.麥康凱培養基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗闆。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。

三、操作步驟

1. 受體菌的培養

從LB平闆上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,直至對數生長後期。将該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養基中,37℃振蕩培養2-3小時至OD600=0.5左右。

2. 感受态細胞的制備(CaCl2法)

1）将培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後于4℃下3000g離心10分鐘。

2）棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。

3）棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受态細胞懸液。

4）感受态細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。

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