Western botting實驗中，樣品一旦準備好，樣品蛋白質通過 PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離，這可以在天然或變性條件下進行。蛋白質印迹指南的這一部分詳細介紹了您在分離蛋白質時可能需要考慮的事項。

本文主要涉及以下幾個方面：· 聚丙烯酰胺凝膠· 緩沖液 pH值· 用分子量标記确定蛋白質大小· 陰性組織對照· 上樣對照

SDS-PAGE通常用于WB實驗，其中蛋白質被變性及還原以獲得它們的初級結構。用SDS分子（Sodium dodecyl sulfate）包被會産生與其分子量成正比的相對負電荷，從而允許僅按大小分離蛋白質。Native PAGE的使用（不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳），一般常用于觀察不同的蛋白質特征。它很少被進一步使用在WB實驗中，更常見的是用考馬斯或銀染色。Native PAGE中的蛋白質遷移率取決于電荷和流體動力學的大小，這些因素都是由多肽折疊決定的。以特定方式折疊的小蛋白質可能比更大、更緊密折疊的多肽具有更大的流體動力學尺寸。此外，可以保留多聚體結構。

SDS-PAGE是通過将蛋白質引入丙烯酰胺凝膠基質并施加電流将帶負電荷的蛋白質拉過凝膠來運作的。丙烯酰胺凝膠基質的密度阻礙了蛋白質的轉運。較小的蛋白質比較大的蛋白質能夠更快地通過凝膠，在電泳期間通過凝膠更遠，并且看起來更接近凝膠的末端。相反，較大的蛋白質抵抗遷移并保持更接近凝膠的開始。包含已知大小的蛋白質marker可以與樣品同時上樣，以校準分離蛋白質的大小。

也可以使用其他類型的凝膠，這些凝膠通過大小以外的特性分離蛋白質。例如，等電聚焦凝膠 (IEF) 凝膠根據蛋白質的等電點 (pI) 分離蛋白質，該等電點對應于蛋白質不帶淨電荷的 pH 值。除了凝膠本身之外，這些其他類型的凝膠通常還需要專門的緩沖液和分子量标記。

将蛋白質樣品裝入樣品孔中，在夾在兩個緩沖液室之間的聚丙烯酰胺凝膠中形成細⻮。垂直電泳儀如圖 1 所示。

圖 1. 垂直電泳儀

第一個室連接到陰極，樣品上樣孔暴露在此處，第二個室連接到凝膠末端的陽極。施加電壓，蛋白質通過凝膠向陽極移動。

蛋白質大小和凝膠基質的密度決定了分離的速度；較小的蛋白質比較大的蛋白質遷移得更快。

準确的蛋白質定性和定量需要高質量的分離，因此需要選用适當的凝膠特性和上樣濃度來确保蛋白質的充分分離。

聚丙烯酰胺凝膠

1. 聚丙烯酰胺凝膠用作分離基質

堅固、親水、熱穩定、透明和相對化學惰性的性質，确保了凝膠在過程中不會破裂或熔化，并且蛋白質很容易被觀察到。化學反應不會幹擾蛋白質的遷移，并且由凝膠密度控制的孔徑可以變化。

2. 不連續聚丙烯酰胺凝膠

PAGE 中使用的大多數凝膠由兩個凝膠區域形成：由較低密度凝膠制成的濃縮凝膠和較高密度的分離凝膠。

較小的蛋白質通過濃縮膠快速遷移，并阻礙了通過分離膠的遷移；較大的蛋白質通過濃縮膠緩慢遷移，并且可能并不會滲透到分離膠中。

3. 梯度凝膠

梯度凝膠用于在同一實驗中分離不同分子量範圍的蛋白質，從而允許從同一樣品中分離低分子量和高分子量蛋白質。凝膠的選擇取決于需要分離的蛋白質。

4. 聚合和澆注凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是通過化學或光引發聚合丙烯酰胺單體和 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺交聯劑的溶液制成的。聚合的化學引發使用過硫酸铵等化合物引發反應，使用 N,N,N ,N-四亞甲基二胺等化合物來穩定鍊式反應。聚合的光引發使用核黃素，将其添加到溶液中并暴露在玻璃闆之間的長波紫外線下，并用水飽和的丁醇覆蓋。

5. 高分子量蛋白質

PAGE 可用于分離5至200 kDa 的蛋白質。對于大分子量蛋白質（700–4,200 kDa），瓊脂糖凝膠比聚丙烯酰胺凝膠更适合用于分離蛋白。

表 1. 不同重量蛋白質的丙烯酰胺凝膠密度适用性。

緩沖液pH值

pH值影響蛋白質遷移；因此，上樣緩沖液的pH值必須高于蛋白質的等電點，以維持它們的淨負電荷，它們才會向陽極移動。連續密度凝膠在兩個腔内使用相同的緩沖液，而不連續密度凝膠則需要一個不連續的緩沖系統。通常使用Tris-glycine緩沖液，其堆積凝膠pH值約為7.0，溶解凝膠pH值在8.0 - 9.0之間。當需要時，可以使用其他專門的緩沖系統。例如，當分離分子量非常低的蛋白質/多肽時，Tricine緩沖液是理想的。

在高pH值溶解凝膠中，半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵。為了解決這個問題，可以在緩沖液中加入還原劑。如果使用Native PAGE，可以添加一種兩性離子氨基酸，如tricine，其緩沖pH值範圍為7.4至8.8，作為替代溶液。

用分子量Marker确定蛋白質大小

蛋白質大小根據分子量Markers進行校準。這些Markers由一系列具有已知分子量的蛋白質組成，這些蛋白質與樣品同時在平行泳道中運行。

未知多肽的分子量可以通過計算标記物的相對遷移距離 (Rf) 與目标蛋白跑膠的距離相比較來估計。分子量标記也是蛋白質轉移效率的有效指标。

預染分子量标記可用于監測電泳過程中蛋白質遷移的進程。在添加免疫試劑之前，還可以通過用染料（例如立春紅）暫時染色膜來觀察标記物。如果凝膠不進行免疫印迹，可以在電泳後用考馬斯亮藍或銀染色來觀察未标記的标記物。

圖2. 跑膠過程中可能遇到的問題和對應的解決辦法

陰性組織對照

陰性對照使用已知不表達靶蛋白的細胞或組織樣本。當這些與需檢測的未知樣品一起上樣時，正确的實驗結果應該顯示為沒有與目标蛋白大小相同的對照帶。

進行陰性對照實驗的目的是識别一抗的非特異性結果。如果陰性對照顯示出條帶，那麼則表示實驗中的一抗與樣品中的其他蛋白（如培養過程中産生的内源性蛋白質）發生了相互作用，而不是與靶蛋白發生相互作用。

另一種有效的陰性對照是進行沒有一抗的免疫印迹實驗，通常稱為無一抗對照。假如在此類對照實驗中顯示出陽性對照，那麼則表明二抗與樣品中的蛋白質發生了相互作用。例如，進行小鼠組織樣本的WB實驗，并使用HRP偶聯的抗小鼠二抗時，假如樣本中含有小鼠IgG，則将會與二抗試劑産生相互作用。

上樣對照

上樣對照用于檢測PAGE 的一緻性，該對照實驗中觀察到的信号可用于在定量過程中使孔之間的測定結果标準化。

上樣對照的一種形式是測量來⾃每個樣品中摻入的蛋白質的信号。這可用于确認在電印迹過程中從凝膠均勻轉移到膜上，并可用于在分析過程中使孔之間的信号标準化。在組成樣品的組織或細胞中表達的管家蛋白，例如肌動蛋白，可用作上樣對照。特别是，他們确認孔中裝載了相同數量的樣品，并且可以識别樣品處理差異。

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