Western Blotting步驟中的一個經常被忽視的方面是有效的樣品制備，有效的蛋白質提取和純化步驟對蛋白質印迹實驗的結果和解釋有重要影響。

　　Western Blotting步驟中的一個經常被忽視的方面是有效的樣品制備，有效的蛋白質提取和純化步驟對蛋白質印迹實驗的結果和解釋有重要影響。蛋白電泳的樣品制備包括從細胞基質中提取和溶解蛋白樣品，去除污染物以及将總蛋白質濃度調節至合适的上樣範圍。

　　細胞裂解和分級分離

　　為進行有效地細胞裂解，産生可溶形式的目标蛋白，需要考慮以下幾個因素：

　　首先，細胞裂解方法，因為不同的樣品類型需要不同的方法才能有效裂解細胞；其次，目标蛋白的亞細胞位置，選擇一種能富集該細胞結構的方法；最後，合适的裂解液以釋放出足量目标蛋白，緩沖液中的除垢劑會影響某些蛋白的裂解效率和溶解性。

　　常規細胞裂解方法

　　Detergent Disruption

　　使用除垢劑

　　除垢劑劑可以溶解易破裂的細胞，如血細胞或組織培養細胞。NP-40等非離子型除垢劑溫和且不變性，但溶解疏水蛋白能力較低。兩性離子除垢劑（如CHAPS）和離子除垢劑（如SDS）可有效增加蛋白溶解性，并使蛋白變性。

　　Mechanical Methods

　　機械方法

　　使用勻漿器、超聲波儀或組織研磨使細胞受力破碎。超聲處理等方法會産生熱量，而使樣品過熱，需使用冷卻方法以避免樣品過熱。在超聲處理期間，浸入冰浴就足夠了。使用研缽和研杵研磨樣品時，需添加液氮保持樣品低溫。通常會同時使用化學破碎法和機械法來最大限度釋放樣品中的蛋白質。

　　Enzymatic Treatments

　　酶處理

　　使用可消化植物或細菌細胞壁的酶對細胞進行裂解處理。例如，纖維素酶和果膠酶（植物細胞）、裂解酶（酵母細胞），溶菌酶（細菌）。酶處理之後通常會再使用另一種破碎方法繼續處理，如超聲。

　　注意：

　　無論采用何種細胞破碎方法，均應除去所有不溶物，以免堵塞凝膠孔洞。上樣前離心 (15°C 下 20,000 x g，持續 15 分鐘)。

　　細胞裂解量建議

　　細胞分級

　　當目标蛋白含量低，或僅存于特定細胞器中，蛋白免疫印迹實驗會變得相對困難。在這種情況下，可以采用亞細胞器分級分離來實現最佳檢測效果。亞細胞器分級分離可以通過差速離心來完成，也可以通過使用特定的裂解除垢劑來實現。

　　例如，通過将細胞與非離子型除垢劑（Triton-X或Tween 20） 一起孵育，可以将疏水性（膜結合）蛋白與親水性蛋白（胞質）分離，從而形成兩個不同的層，疏水層和親水層。也可以使用下述可選的除垢劑靶向不同的亞細胞成分。

　　Cell Fractionation

　　裂解液推薦

　　細胞器位置

　　裂解液推薦

　　總細胞裂解

　　NP-40

　　核

　　RIPA或核分級分離，以提高目标蛋白濃度

　　線粒體

　　RIPA或線粒體分級分離，以提高目标蛋白濃度

　　細胞質

　　Tris-HCl

　　膜結合蛋白

　　RIPA（SDS是強力除垢劑，通常适合難以溶解的蛋白質）

　　通常情況下可使用離心法分離勻漿後的線粒體，細胞核和内質網。如果需要富集特定細胞器，則可以使用細胞分級試劑盒，特别是要檢測低表達蛋白時。細胞分級分離過程首先是通過勻漿裂解細胞，開始以較低的速度離心，然後逐漸過渡到較高的離心速度。此過程需要知道目标蛋白的表達位置，并使用正确的蛋白酶和磷酸酶抑制劑。

　　蛋白質溶解和穩定

　　為保證電泳成功，必須破壞蛋白質之間的聚集作用。理想情況下，細胞裂解和蛋白的溶解都在電泳樣品緩沖液中進行。如果無法做到這一點，則必須在增溶溶液中制備蛋白，該溶液應含有除垢劑、變性劑/還原劑，以及兼容電泳的緩沖液。

　　裂解緩沖液包含不同的除垢劑，可幫助破壞細胞并釋放蛋白，從而使它們溶于溶液。但是，每種蛋白質都是不同的，它們與緩沖液和除垢劑的反應可能不一樣。如果目标蛋白沒有在溶液中溶解，或者蛋白-蛋白相互作用比較特殊，則需要嘗試使用其他特殊緩沖液，并交換去除除垢劑。

　　全細胞裂解物和膜結合蛋白 — 最常用的緩沖液是 RIPA 和 NP-40。RIPA 緩沖液的強力特性适合難溶蛋白。

　　核/線粒體蛋白 — 首選RIPA。但是，通常首先使用分級分離方案來增加特定細胞器及目标蛋白的濃度。

　　細胞質蛋白 — Tris-HCl 有時比 RIPA 緩沖液更有優勢。需要實驗測試确定最佳條件，以獲取更多的目标蛋白。

　　天然狀态蛋白質 — CHAPS 是兩性離子除垢劑，特别适合保護蛋白的天然狀态。常用于等電聚焦 （IEF） 和 2-D 電泳。

　　核/線粒體蛋白 — 首選 RIPA。然而，分級方案通常首先用于增加目标蛋白所在細胞器的濃度。

　　裂解緩沖液配方

　　NP-40

　　150 mM NaCl

　　1% NP-40 or Triton X-100

　　50 mM Tris pH 8.0

　　RIPA

　　150 mM NaCl

　　1% NP-40 or Triton X-100

　　0.5% sodium deoxycholate

　　0.1% SDS

　　50 mM Tris, pH 8.0

　　Tris-HCl

　　20 mM Tris-HCl, pH 7.5

　　CHAPS

　　150 mM KCl

　　50 mM HEPES (pH 7.4)

　　0.1% CHAPS

　　還原劑

　　許多蛋白質通過二硫鍵形成多聚體，加入還原劑會破壞這些二硫鍵，從而使樣品中的蛋白質以單體形式存在，以下是一些常見的還原劑及其典型用途。

　　還原劑特點及應用

　　蛋白質穩定化

　　細胞裂解後，由于細胞内酶活性的存在，蛋白質會開始發生水解、去磷酸化及變性。在冰上或4°C下制備樣品，加入蛋白酶/磷酸酶抑制劑等方法可将酶活性降至最低，裂解緩沖液應在使用前新鮮制備。

　　可使用市場上的即用型混合抑制劑（專有配方），也可以根據個人需要自制混合緩沖液。下表列出了常見的蛋白酶/磷酸酶抑制劑，它們的靶标以及建議的在裂解緩沖液中的終濃度。

　　常用蛋白酶抑制劑

　　常用磷酸酶抑制劑

　　蛋白樣品定量

　　在電泳上樣前，需要知道每個樣品中總蛋白濃度，以确保适當的蛋白上樣量，避免凝膠過載。此外，還需要保證每個泳道上樣量接近，以确保在相同的基礎上比較不同樣品的目标蛋白表達水平。

　　測量蛋白濃度的最常用方法是檢測280 nm或205 nm處的吸光度。另外還有幾種其他測定方法，如Bradford，依賴于肽鍵的金屬離子還原反應；如Lowry和BCA測定法，通過染料結合或還原反應。以上幾種定量方法都基于類似的理論基礎，即産生與樣品中蛋白質量成正比的顔色變化。通過将目标樣品與已知标準系列（通常為裂解液中稀釋的牛血清白蛋白）進行比較來确定蛋白濃度。為了獲得準确的蛋白濃度測量值，最好測試一些樣品稀釋液，以确保結果在測定的線性範圍内。

　　上樣緩沖液

　　确定蛋白濃度後，将樣品在凝膠上樣緩沖液（通常為 Laemmli 緩沖液）中稀釋。該緩沖液含有甘油，從而使溶液比凝膠電泳緩沖液黏稠，樣品容易沉入凝膠上樣孔中。上樣緩沖液還包含跟蹤染料（溴酚藍），該染料也會在凝膠中遷移，指示電泳遷移距離，顯示電泳進展情況。

　　将樣品在上樣/樣品緩沖液中100°C加熱5分鐘，或70°C加熱10分鐘以幫助蛋白變性。變性後的蛋白樣品可放置在室溫，以備電泳上樣；如樣品不需要立即電泳上樣，也可置于4°C 或 –20°C 長時間保存。

　　樣品緩沖液條件

　　樣品緩沖液配置技巧

　　防止降解

　　離心混合物後，需要添加裂解緩沖液和混合蛋白酶抑制劑。可能需要使用不同濃度的混合蛋白酶抑制劑重複此過程，以獲得足夠高的蛋白濃度。

　　定量樣品

　　定量樣品中的總蛋白含量可确保樣品的均等電泳上樣。當需要量化不同泳道目标蛋白時（例如在比較對照和實驗處理的細胞之間時），這一點尤其重要。相等的上樣量使分析時的歸一化因子變化更小。

　　電泳前去除不溶物

　　細胞破裂後，在 15°C 以 20,000 x g的速度離心 15 分鐘以除去所有不溶物。固體顆粒可能會堵塞凝膠孔洞。

　　更多幹貨内容可前往公衆号獲取。

　　end

　　注：本推文未經許可禁止轉載。

　　,

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!