植物組織培養技術解決什麼問題?1.微生物污染問題1.1造成污染的原因，我來為大家科普一下關于植物組織培養技術解決什麼問題?下面希望有你要的答案，我們一起來看看吧!

植物組織培養技術解決什麼問題

1.微生物污染問題

1.1造成污染的原因

（1）外植體材料本身帶菌；（2）接種過程中接種工具滅菌不徹底或者交叉污染；（3）培養基滅菌不徹底。

1.2防治措施

（1）外植體滅菌要徹底。首先可以選擇組織内部無菌材料；其次根據不同的材料選擇不同的消毒劑和消毒時間；第三外植體消毒要細心，比如莖段消毒，經過消毒處理後，要把兩端切去約0.5cm，這樣就可以大大減少污染的概率。

（2）嚴格遵守無菌操作規程。操作人員在進入接種室前一定要洗手，然後換上接種服，帶上口罩，操作之前先用75%的酒精擦拭雙手，接種工具要經常灼燒一保證不會帶菌或者交叉污染。

（3）加抗生素。在培養基中适當的加入抗生素可以有效防止污染。

（4）無菌培養環境。培養室内要定期進行滅菌，可在室内裝紫外燈，或者用高錳酸鉀和甲醛熏蒸，或者利用其它的熏蒸劑進行滅菌。

（5）控制外植體的接種數量。每個培養瓶中盡量接種少量的外植體。

（6）及時繼代培養。定期檢查組培苗的生長情況，發現有污染苗頭的組培苗及時轉接到新鮮培養基上。

2.褐變問題

2.1影響褐變的因素

（1）外植體材料的基因型；（2）外植體的生理狀态；（3）培養基成分。

2.2防治措施

（1）選擇适當的外植體。選擇處于旺盛生長狀态的外植體，對于容易褐變的植物注意對其不同品系的基因型進行篩選，選擇褐變率較低的材料作為外植體。

（2）在培養基中加入還原性物質或者吸附劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸等抗氧化劑；或者加入0.1-1%的活性炭吸附培養物在生長過程中分泌的酚類、醌類物質，但是要注意活性炭也可以吸收培養基中的激素使之濃度降低。。

（3）對培養材料進行預處理。用抗氧化劑溶液進行預處理或者在接種前用無菌水洗淨切口滲出的酚類物質。

（4）适當的培養條件。在培養初期保持較低溫度（15-20℃），可以降低PPO活性，防止酚類物質氧化，減輕褐變。

（5）其他措施，培養初期進行連續轉接。

3.玻璃化問題

3.1影響玻璃化的因素

（1）外植體材料；（2）培養的環境條件；（3）培養基成分，瓊脂的濃度、碳源的種類及含量等；（5）封口材料。

3.2防治措施

（1）降低NH4 濃度，減少培養基中氮化物的含量。

（2）降低細胞分裂素的含量。

（3）适當增加瓊脂的濃度，以降低培養基的水勢。

（4）增加光照強度和光照時數。

（5）在培養基中加入5-10mg/L的PP333。

1．兩次培養基用的配方都一樣，為什麼一個凝固的特好，一個就凝固不了？

答：培養基的凝固與否無外乎有下列幾種情況：

（1）．瓊脂批次有變，沒有做批次試驗，沿用以前的用量造成不足。

（2）．大量元素重複加入，或大量元素母液配制時出錯。

（3）．pH值調得過低，或有活性炭高壓滅菌時間過長，造成蔗糖分解量劇增，影響培養基的pH值降低較多。

（4）．加入新的天然附加物，或附加物過多。

2．75%的酒精和70%的酒精有什麼區别，組培時用哪種好?

答：酒精的70%和75%都是可以的，但往往由于桶裝酒精的濃度達不到95%，這樣按照70%的配制就達不到要求了，因此我們一般是桶裝按照75%的配，瓶裝則按照70%的配。

3．大型滅菌器在滅菌的時候總會出現個别瓶子破裂的現象，請問什麼原因？是溫度過高，壓力過大，還是内部冷熱不均造成的呢？

答：高壓滅菌造成玻璃瓶的破裂，特别是大型滅菌裝置，我想最主要還是在放氣冷卻時造成的。究其原因，應該是在放氣時，由于容積較大，壓力在不同位置（内外部）的變化速度并不相同，緻使瓶内與瓶外的壓力差距較大，如果是封口膜，表現的可能就是塑料膜的破裂。

4．初代培養時，外植體出現發白，慢慢枯死，是什麼原因？

答：外植體的初代培養出現這種情況，是比較好理解的。大田植物材料離體以後，進入不同環境中繼續生存代謝，需要一個過渡。首先，植物材料要吸收培養基的養分，不再是根吸收，鹽類濃度相對于離體的植物材料的吸收能力可能是過量的，植物材料褪色就是葉綠素形成受阻和細胞代謝受阻，另外還有培養基養分供應的有效性滞後，另外還有植物材料本身内含物向培養基的流失等等。建議在初代培養階段最好先采用空白培養。

5．做無毒苗的快繁，一直找不到合适的培養基，能不能幫我推薦一種？

答:關于組培快繁的方式概括起來有下列兩種途徑：

（1）、外植體－愈傷組織－再生芽－繼代－生根－出苗

（2）、外植體－叢生芽－繼代－生根－出苗

至于采取哪種途徑，需要徹底了解所選組培植物的生物習性，包括繁殖方式，頂端優勢，萌孽生根能力等。

6．一般情況下KT的母液應該配成多大濃度？IAA能高壓滅菌嗎？高壓滅菌成分會變嗎？

答：KT一般配成0.05－0.1ppm。IAA極不耐高壓滅菌，一般采用過濾滅菌。

如果利用高壓滅菌劑分解率會在85%以上，緻使其作用不明顯。

7．請問植物病毒檢測的簡便方法？

答：由于經過脫毒處理，即使未完成脫除病毒的植株，其體内病毒的含量也會較低，常常在最初的一、二次病毒檢測中呈陰性，因此有人建議在前18個月内，必須對植株進行若幹次檢測。目前常用的植物病毒檢測方法有可見症狀鑒定、寄生鑒别、抗血清檢測、電鏡檢測、分子檢測等。可見症狀鑒定法較簡單，但準确性差，對于不表現可見症狀的隐症病毒幾乎無效；而電鏡檢測、分子檢測雖然檢測準确率高，但設備昂貴，尤其電鏡不可能每個組培室都配備，故未在生産上廣泛運用；目前生産上，國内外仍主要采用鑒别寄主的酶聯免疫檢測法檢測植物病毒。

8．組培苗生長環境有何特點？如何針對這些特點提高移栽成活率？

答：組培苗煉苗是組培過程中較為重要的一個環節，是一個較為複雜的技術體系，提高煉苗成活率是決定組培成敗和降低組培成本的關鍵。試管苗一般在高濕（100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒溫（25℃）下培養，生長的植株有以下幾個特點：（1）、葉片無保護組織（角質層、蠟質、表皮毛等），加之細胞間隙大，氣孔開張大，因此水分散失較快，易于萎蔫。(2)、根無根毛或極少，并且有些從愈傷組織上發育的根與芽的疏導組織不相同，因此吸水能力較弱。而當煉苗移栽時，環境有了極大的改變：濕度降低、光照增強、溫度升高、溫差變大。具有以上特點的組培苗，在此環境下，葉片失水較嚴重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸騰水量，從而造成植物萎蔫，煉苗失敗。另一種情況是，空氣溫度上升要比基質溫度上升快，而根系的吸水能力在一定範圍内與溫度是成正比的，當氣溫升高時，加之濕度較低，葉片蒸騰急速增加，此時基質溫度上不去，根系吸水能力不夠，造成蒸騰大于吸水的失衡狀态，從而萎蔫死亡。要想獲得高的煉苗成活率就得針對以上問題，一方面提高出瓶苗的質量，提高其抗逆性，生根前的壯苗、理想的生根配方和生根培養環境的調控是關鍵；另一方面就得有針對組培苗特點創造一個适宜的煉苗環境，比如保證空氣濕度，平衡空氣和基質的溫度平衡關系等。

9．有些植物在組培生根階段會把大量元素和糖減半，根據什麼來判斷是否需

要減半？

答：在組培過程中，我們提起配方往往隻局限于激素的配比和添加物的使用，

其實對基本培養基的構成和培養條件（溫度、光照、濕度、PH等）都屬于配方的範疇。在這方面的調整主要是根據實際培養狀況靈活調整。在生根階段，試驗證明培養基高滲透勢或液體培養基有利于營養素和激素的運轉，有利于根的發生和形成，因此大部分植物在生根過程需要調整基本培養基的組成。但具體需不需要應該通過對比試驗确定。

10．什麼是濾紙橋生根？

答：1）濾紙橋生根技術是分化苗直接瓶外生根技術，其作用主要是簡化生根環節，提高煉苗成活率，降低組培成本，同時還可以對污染苗進行最大程度的利用。

11．人工種芽的形成标志是什麼，怎樣才能算是一個完整的人工種芽？

答：一個完整的人工種子是由體細胞胚、人工胚乳和人工種皮三部分組成。

它的優勢在于：(1)、培養條件可以人為控制，省地省工，可直接播種。(2)、人工種子制作時，可加入營養物質、植物生長調節劑、固氮菌、殺蟲劑等。(3)、以用于生産人工種子的體細胞胚，可以利用生物反應器大規模生産，效率極高。(4)、一些珍貴種苗或樹種可以通過人工種子，加速其生産應用。

存在問題：(1)、并非所有植物都能培育出大量高質量的體細胞胚。(2)、目前的人工胚乳和種皮還不夠理想，不能有效防止微生物的腐蝕。(3)、人工種子的貯藏問題有待于進一步完善。

12．在組培中胚狀體在外部形态上是如何與愈傷組織區别的？

答：大量實驗證實，植物體細胞具有成胚的潛力，由體細胞形成的胚狀體叫體細胞胚。一般情況，體細胞組織形成愈傷組織之後3周内，在愈傷組織上出現大量胚，這些胚是由愈傷組織外層細胞以及深部細胞起源的。在離體或活體條件下，體細胞經原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷胚期和子葉期等階段形成的胚叫體細胞胚狀體。從外植體或愈傷組織表面産生胚狀體的情況較為常見。

從愈傷組織向球形胚過渡的标志是細胞的活躍分裂形成一團緻密的沒有表皮層

的細胞團結構，可以明顯地與疏松的愈傷組織區分開。

鑒别胚狀體的标準：（1）胚狀體具有極性，也就是說胚狀體在發育的早期階段，在其相反的兩端分化，分别出現莖端和根端，是一種單極性結構。（2）在組織學上，胚狀體的維管組織與母體植物或外植體的維管組織一般沒有聯系，

其維管組織的分布呈“Y”字形。而根或芽的分化，裡面長出原形成層束，與愈傷組織形成的或外植體中的維管組織往往相連。

13．如果在配制母液時，将大量元素和微量元素摻在同一個罐子内，會對植物有影響嗎？

答：母液配制，主要是考慮到母液穩定性問題，根據化學反應原理，濃度很高的大量元素中的陰離子，對微量元素的金屬離子來說是過量的，因此若混在一起，微量元素中的金屬離子會很容易發生水解反應，生成沉澱，從而失效。長時間使用這樣的母液，就會發生生理病害，比如缺素症（黃葉，葉不展，萎縮變脆等）。建議使用幹粉式培養基。

14．植物組織培養的培養基為什麼隻用蔗糖而不用葡萄糖？為什麼動物培養的培養液中用葡萄糖而不用蔗糖？

答：這個問題我覺得應該從植物與動物的生理機制去思考。植物與動物的最大差别就是植物是自養型的（光合作用）而動物是異養型的（外部吸收代謝）。植物光合産物是多糖（二碳糖以上，包括蔗糖），貯藏産物形式是澱粉，而澱粉的合成前體就是蔗糖。蔗糖＝葡萄糖＋果糖，所以蔗糖的合成必須同時要有葡萄糖和果糖，其實植物也隻能吸收葡萄糖和果糖。在組織培養中加入蔗糖，經熬煮和高壓滅菌後就會分解成植物能夠吸收的葡萄糖和果糖形式。其實這樣看來在組培中，植物也有部分異養的特點，如果在培養基中缺少任何一種糖的形式，植物在自養能力（光合，呼吸，産物代謝等）較差的情況下，就難免會影響其生理代謝。與植物不同的，動物是異養型的它不需要澱粉的積累，也沒光合作用，動物細胞本身所處的生理環境和代謝方式就決定了它對糖形式的要求了。

15．如何利用組培技術培養一棵未知植物？

答：作為未知植物的組培，我想應該歸為珍稀植物材料的範疇。一是數量有限，二是不曾命名，三是無文獻可查。這種材料如果性狀優良，進行組培快繁是相當必要的。一般可以通過以下步驟開展工作：（1）、觀察植物的生物學性狀，進行植物歸類和屬種劃分。（2）、确定植物的繁殖方式（分蘖、種子、扡插、根莖等），比較組培繁殖的優勢。（3）、根據植物特性（頂端優勢，萌蘖能力等）确定組培發生方式。（4）、小量無菌外植體系的建立，确定高效外植體獲得方法。（5）、大量外植體群體建立，誘導分化配方設計。（6）、确定最好分化的繼代配方。（7）、生根配方設計與确定。（8）、試管苗出苗。（9）、大田栽植，觀察組培苗生物學性狀，與母本比較鑒别，确定優良性狀的遺傳穩定性。（10）、工廠化繁殖，市場化運作。

16．在初代培養階段，成功地誘導出綠色的愈傷組織；進行繼代培養時愈傷組織增殖很快，卻始終沒有出芽，如何解決不産生不定芽的問題？

答：愈傷組織誘導成功後，如何有效地誘導出不定芽是相當重要的。外植體産生愈傷組織的時間和愈傷生長的程度，随不同植物種類和培養條件有較大的差異。有些植物形成不定芽比較容易，能夠直接從外植體受傷的或沒有受傷的部位分化出不定芽。一般認為細胞分裂素/生長素的比值是控制器官發生的重要因素，調整他們的适當比值就可以有效的控制愈傷組織的芽、根等器官的分化。在此理論下，愈傷組織誘導不定芽的能力，與愈傷組織的狀态密切相關，能夠誘導形成分生細胞團至關重要，分生細胞排列較為規律，較大的在外，越向内細胞越小，排列也越緊密，細胞質濃厚，核相對較大，這樣的分生細胞在激素比值調控的情況下，就很容易形成不定芽。這也就是為什麼愈傷組織在繼代的時候要交替使用不同激素的原因。

17．NAA和2，4-D哪個生長素促進愈傷誘導效果更好？

答:對于愈傷誘導和增殖來說，2，4－D效果要比NAA明顯；但有一個問題，很

多情況下，2，4－D誘導的愈傷比較難以再生芽。

18．滅完菌，凝固好的培養基上面會有一層水是什麼原因？如果将植物材料轉接于這樣的培養基中，會有什麼後果？

答：培養基滅過菌後或多或少會有積水現象，一般來說冬天要輕一些。如果積水太多接種的時候倒出來，不然容易造成容器壁水珠比較多，影響光照，從而造成玻璃化現象加重。

19．在組培中，葉片較易脫落，是什麼原因引起的呢？

答：葉片脫落是對逆境的一種表現，溫度過高、透氣不良、培養物過于密集、久不轉移、有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會引起植物材料的落葉或黃化。

20．空白培養是什麼意思？

答：空白培養在高效外植體系的建立方面是很有用的步驟，空白培養就是不加任何激素的培養過程。對于外植體迅速适應瓶内環境和有效外植體群體的建立是很有用的。

21．如果芽體隻是長高，不膨大也不分化，有的靜止不動，請問這會是什麼原因引起的呢?

答：成活外植體如何成功啟動是組培過程中至關重要的環節之一。由于大田植物材料其激素水平和細胞活性差距較大，如何迅速将外植體對培養基條件做出反應也有很多方法，首先芽體萌發時應用赤黴素，黑暗培養，高低激素配合使用等都會起到很好的效果。

22．用幼芽啟動用于分化芽的愈傷，NAA與6-BA的比例有一般規律嗎？還有用2，4-D啟動的愈傷再轉到隻含NAA和6-BA的培養基中，愈傷變為綠色，有分化的可能嗎？

答：離體的愈傷組織是一種正在增生的非組織化的細胞群，可以從幾乎任何類型的植株獲得。由外植體形成愈傷組織很少是自發的，它代表創傷反應的擴展，一般要求在培養基中有生長素，常常還要求有細胞分裂素同時存在。最有效地産生愈傷組織的激素濃度随所用的植物及器官而異，但其比外植體直接誘導苗所需的濃度要高。大多數植物中愈傷組織可從外植體上分離開，并可進行繼代培養和連續繁殖，所使用的培養基中所含的激素水平，與用于誘導愈傷組織時相同。如果降低激素水平，或适當調節生長素對細胞分裂素的比例，某些愈傷組織将再生出苗或胚。

23．洋蔥也能加在培養基中？能說說它的機理嗎？

答：培養基中添加有機附加物，如馬鈴薯、香蕉、椰汁等，主要是由于他們含有豐富的糖、蛋白質、各種無機鹽、維生素以及各種活性物質。洋蔥也不例外，除了含有豐富的營養物質之外，洋蔥還含有豐富的硫化合物，是強有力的抗菌成分，能殺死多種細菌。

24．在壯苗生根培養基中培養，會有黃葉出現，葉子都枯了。是什麼原因引起的?

答：組培苗的黃化是由培養基成分、環境、激素、碳水化合物等各種因素引起的，但這樣的解釋是比較抽象的。我覺得在壯苗生根階段，由于培養基的變化，特别是激素的改變導緻培養基高壓滅菌後PH變化與分化階段是有較大差别的，加之苗子與培養基接觸面積的變小，營養供應滞後。所以當根長出來以後，會有不同程度的改變。如果解決的話，還應該确定一下生根培養基高壓滅菌後的pH變化，進行适當調整，同時在分化時進行适當壯苗調整也是比較好的方法。

25．請問：（1）接種前，接種工具要浸泡在酒精中，所使用的酒精濃度是75%還是95%？（2）我用新鐵炮百合鱗片作外植體，對鱗片切割有沒有什麼方法可以減少污染，書上講根據極性方向接種到培養基上，怎麼判斷極性呢？（3）使用玻璃瓶和不鏽鋼的蓋子作為培養容器，透氣性是不是不好，會影響培養效果嗎？

答：接種工具接種灼燒前浸泡酒精的濃度，可以是75%也可以是95%的。至于極

性指的就是植物材料有趨向發育的特征。比如是莖繁，靠近莖頂端發出芽子，

遠離莖頂端會長出根。是根繁的話，新芽發生于近心端，新根發生于遠心端。因此在接種時，盡量不要使材料倒置，盡量保持植物的極性方位，不能将莖端插入培養基内。培養容器的透氣性是決定瓶内濕度和氣體狀況的主要因素，因此如果過于密封，使瓶内外得不到氣體交換，就會不同程度的受到影響。建議使用透氣性好的培養容器。

26．生化培養箱可以進行植物組織培養嗎？它與光照培養箱有什麼不同？

答：光照培養箱主要是模拟植物的光照條件，更适合植物的培養、種子發芽等的實驗，而生化培養箱更偏重于溫度、濕度的控制，微生物實驗等比較合适。

27．高壓滅菌後培養基的pH會變大還是變小？MS和1/2MS哪種培養基pH變化更大？

答：培養基滅菌後pH會降低0.2左右，其主要原因就是有機物的分解，特别是維生素、氨基酸和糖，因此MS會比1/2MS培養基pH變化更大。

28．内生菌造成的污染在外觀上怎麼辨别？

答：内生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官的細胞間隙或細胞内的細菌，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織内直接産生擴增出微生物DNA的方法來證明其内生。在植物組織培養中，由于材料内部的内生細菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料帶入培養過程，從而引起的污染稱為内生細菌污染。從污染狀态來看，是發生于植物材料周圍，一般會由培養基内向外延展，并且發生的時間也會比接觸性污染要長，接觸性的細菌一般在2－4天表現，内生菌則會超過4天，并且菌的種類也相對單一。

29．水解酪蛋白有酸水解，有酶水解，在使用過程中有沒有區别，他們的在培養基中的作用是一樣的嗎？

答：水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）是多種氨基酸的混合物，對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用，通常用量在500mg/L，特别是當有高水平IAA存在時更是如此。對于酪蛋白不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，但考慮到組培苗的異養功能，酸解應該更有利于發揮其作用。

30．有些樹種受傷後會分泌出一些白色的漿液，比如梓葉槭，不管是莖段還是葉片，隻要有傷口的地方都會有漿液，而這會加重外植體的褐化，請問應該怎麼處理呢？

答：這是植物的傷流現象。由于傷流液中含有酚類物質，因此在培養中極易引起褐變。許多研究表明，選擇适當的外植體和培養條件是克服褐變的最主要手段。通常外植體應有較強的分生能力，在最适宜的細胞脫分化和再分化培養條件下，使外植體處于旺盛的生長狀态，便可大大減輕褐變。适宜的溫度和在全黑暗條件下進行培養也可顯著減小外植體的褐變。液體培養和連續轉接也是很好的措施。另外，加入一些氧化劑或用抗氧化劑進行材料（外植體）的預處理或預培養，可大大減輕醌類物質的毒害。這些抗氧化劑包括：VC、檸檬酸、硫代硫酸鈉等。此外，0.1％-0.5％活性炭對吸附酚類氧化物的效果也很明顯。

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