做蛋白組學研究的朋友，在閱讀文獻或了解蛋白質譜檢測的過程中一定看到或者聽到技術人員介紹過TMT、label-free、4D蛋白質組和DIA等這樣的名詞或者項目。您或許還未搞清楚他們的意思，今天，小編就帶大家了解這些名詞或者項目的區别。

iTRAQ/TMT分别是由美國 Thermo 公司和 AB SCIEX公司研發的多肽體外标記定量技術，是目前運用最廣泛的兩種标記定量蛋白質組技術，具有相似的原理，兩主要區别在于：TMT最高可同時标記16組不同的生物樣品，iTRAQ最高可同時标記8組不同的生物樣品。

以TMT為例，一組TMT标簽試劑裡的所有标簽，均帶有相同的質量。化學結構則由質量報告基團、質量平衡基團和肽反應基團構成，其中肽反應基團可以和肽段的N-term或末端賴氨酸側鍊基團的遊離氨基共價結合，從而使全部肽段标記上TMT标簽。不同的TMT标簽有不同質量的報告集團，通過質量平衡基團的平衡保持不同的TMT标簽總分子質量相同。肽段在進入二級質譜時，質量報告基團因碎裂而被釋放，在質譜低質量區産生報告離子峰，該質譜信号強度即反應了某一種肽段在不同樣本中的相對表達量。

TMT标簽化學結構圖

因此使用同位素可以對不同樣品進行标記，然後将同一批樣品一起上機進行檢測，根據不同的同位素标記來區分各個樣品中不同蛋白的表達量。這種技術方法的優勢是：定量準确，數據重現性好，靈敏度高對樣品要求量低，檢測蛋白數量多。缺點是由于同位素标記最多隻有16種，樣品量大的時候需要在每次上機時加内參樣品，增加了成本。另外，無法剔除離群樣本進行重新分析，這也是TMT蛋白質譜應用的限制。

相對于TMT對蛋白的标記定量，Label free無需使用昂貴的穩定同位素标簽做内部标準，每個樣品單獨上機，隻需分析大規模鑒定蛋白質時所産生的質譜數據，比較不同樣品中相應肽段的信号強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量。Label free的優勢是無需依賴同位素标記，每例單獨檢測，因此實驗設計靈活，适合臨床大幾十例、上百例樣本的檢測，同時也能看到樣本中的 “有還是無”的蛋白。缺點是對儀器的穩定性、實驗人員的操作等可能産生系統誤差的因素要求極高。

4D蛋白質組技術是新一代蛋白質組學分析技術，由布魯克公司與蛋白質組學領域的領軍人物Matthias Mann，Ruedi Aebersold，Ben Collins和Hannes Roest等科研團隊合作推出的技術。布魯克的4D蛋白質譜TimsTOF Pro，基于雙Tims和PASEF的數據采集模式，具有更高的采集速度、靈敏度和特異性，引領臨床蛋白質組學在鑒定準度、鑒定深度、定量準确性、檢測周期等性能上全面提升。

4D蛋白質組學

了解DIA和DDA之前，我們先要簡要了解下當前基于LC-MS/MS蛋白質譜的基本流程：準備樣本——抽提和純化蛋白質——胰酶消化成肽段——液相色譜分離（LC）—— 一級質譜檢測（母離子信号）——肽段破碎進入二級質譜檢測（用于确定氨基酸序列）——數據分析。

DIA和DDA指的就是兩種進行二級質譜的數據采集模式。DDA是一種選擇性數據采集方式，而DIA是數據全掃描采集方式。

兩者的區别比較如下表所示

因此，相對于傳統的是DDA，DIA具有如下技術優勢：

1. 全景式掃描，數據無遺漏，蛋白質覆蓋率、定量準确性高；

2. 樣本無需分餾分上機，極大縮短了每個樣品的檢測周期；不受樣本量限制，可用于大規模樣本數量檢測；

3. 相比于DDA模式，DIA缺失值更少，鑒定與定量結果的可重複性更高，數據可回溯。

基于新一代的賽默飛Exploris 480和布魯克timsTOF Pro，吉凱基因開發了DIA 2.0産品，相比常規DIA常規路線，性能有極大提升，主要優勢如下：

• 更高檢測靈敏度，挑戰質譜分析極限
• 更高檢測深度和覆蓋度，提高50% 鑒定量
• 定量重複性、完整性、可靠性全面提升

TMT蛋白質組是指使用TMT标簽對樣本蛋白進行标記并混樣上機的一種蛋白質譜檢測方法，一次性最多能實現對16個樣本的檢測。而相對于标記，Label free則是一種不進行蛋白标記、逐一對樣本進行蛋白質譜的方法，也是目前使用更廣泛的一種方法。

4D蛋白質組則是指相對于傳統質譜儀對肽段保留時間、質荷比（m/z）和質譜強度的三維蛋白檢測，增加了離子淌度的（ion mobility）的四維蛋白檢測，是質譜儀器性能的提升。4D蛋白質譜儀有更高的分辨率。吉凱基因的4D蛋白質組學使用的是德國布魯克公司的4D質譜儀——Timstof Pro。

DIA：Data Independent Acquisition即數據非依賴的采集，是相較于數據依賴采集（DDA，Data Dependent Acquisition）的一種數據采集模式。相較于DDA，DIA是一種更全面的數據采集模式，适用于大樣本量的研究。而DIA采集模式下， 傾向于采集高豐度蛋白信息，因此其缺失值更多，不适合進行大樣本規模的蛋白質譜研究。

吉凱基因根據研究者的不同需求，提供差異化的蛋白組學技術服務，主推産品總結如下，歡迎前來咨詢。

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