近日，Nature Communications 發表了中國科學院合成生物學重點實驗室楊晟研究組題為CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum 的研究成果，發現新兇手弗蘭西斯菌來源的 Cas 效應蛋白(FnCpf1)與谷氨酸棒杆菌适配，而 SpCas9 則表現出對谷氨酸棒杆菌的毒性，并建立了高效的谷氨酸棒杆菌 CRISPR-Cpf1 基因組編輯系統。

CRISPR-Cpf1-recT系統可在谷氨酸棒杆菌基因組上高效原位飽和突變以篩選高産菌

今天小編特地請來相關科學家與大家聊聊“CRISPR-Cas 引領基因組手術的變革”。

人類的健康問題一直是社會焦點，備受關注。我們或許未曾擔憂或同情過視線分辨率之外微生物們的健康。然而，它們也會生病，在複雜的外部環境中，各種外源DNA通過轉導、接合轉移、轉化等方式入侵，例如噬菌體的感染，都會嚴重影響細菌的正常生長。在與病毒抗争的漫長歲月裡，微生物們逐漸進化出了特異的免疫系統來保護自己，CRISPR-Cas系統便是其中的一種免疫方式。

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), 英文直譯為“成簇規則的間隔短回文重複序列”，存在于約90%的古菌40%的細菌基因組中。這些微生物們通過發明 CRISPR-Cas 系統來辨别入侵的DNA, 如圖1 所示，CRISPR的基因座中通常包含幾個非連續的直接重複序列，這些序列被一些可變序列分隔開來。這些可變序列與入侵病毒的DNA相匹配，當有相應外源DNA入侵，便會被微生物識别，此時，CRISPR-Cas 系統中的Cas蛋白便可以對外來DNA進行切割，保護微生物不被侵染。這樣的免疫過程包含了對特異DNA序列的識别以及切割過程，當其神秘面紗被揭開的時刻，科學家們發現了這把新型的基因組“手術刀”，便思考着是否能将其應用于基因組的編輯呢？因此CRISPR-Cas系統中的多個Cas蛋白得到了解析，其中核酸酶Cas9與Cpf1這兩把潛力非凡的基因組“手術刀”備受關注，被廣泛應用于基因編輯工作。

圖1 細菌的CRISPR-Cas系統免疫過程

什麼是基因編輯？基因編輯也就是在活體細胞的基因組中進行DNA的插入、缺失或者替換。這樣的基因組手術是遺傳工程的一種形式，可通過對目的基因的改造，進而觀測該基因改造對生物産生的表型影響，從而實現對基因功能的研究，被廣泛應用于生物研究領域。

進行基因編輯手術的過程需要一把鋒利的“手術刀”，對細胞的靶向基因位點進行切割，引入雙鍊斷裂，此時細胞自身的修複機制便會被啟動，對“傷口”進行修複，從而輔助完成基因編輯過程，根據人工引入的外源修複片段的差異，實現目标基因的插入、缺失或者替換。

從上述基因編輯過程來看，想要進行基因組任意位點的編輯手術，需要一把能夠在指定位置切割的“手術刀”，也就是一種可以人工設計識别位點的核酸酶，因此，尋找一把稱心如意的“手術刀”，是我們進行“基因手術”所需攻克的難題。

在真核生物中，CRISPR-Cas的“基因手術”出現之前，主要依賴鋅指核酸酶 (ZFNs)和TAL (TALENs)效應核酸酶這兩把“手術刀”來進行基因編輯。然而，在實際操作過程中，每換一個編輯位點就需要對核酸酶“手術刀”進行重新設計一次，這樣重新設計、合成、驗證“手術刀”的過程太過繁瑣、耗時，使得這兩種方法難以快速大規模地使用。

然而CRISPR-Cas系統卻有着獨特的特點，核酸酶Cas9與Cpf1這兩把手術刀對基因的識别過程不依賴于自己的蛋白結構改變，而依賴于一段特異RNA的引導。也就是我們隻需要設計需要改造位點的RNA序列，它便可帶領着Cas9或者Cpf1去指定的位置切割基因組，引發細胞的基因修複，從而進行DNA插入、缺失或者替換，完成整個基因手術過程。

和傳統的兩把“手術刀”相比，科學家們在基因手術準備中無需對蛋白進行設計，隻要簡單設計靶向位點的核酸序列，便可進行基因編輯，與傳統方法相比，操作簡單，省時快速。

如圖2所示，設計與目标基因組切割位點匹配的gRNA後，gRNA便會指引Cas9對基因組進行切割。除了上述在真核生物中的基因編輯外，Cas9與Cpf1也被廣泛應用于微生物領域，進行基因組編輯工作，目前使用較多的是來源于釀膿鍊球菌的Cas9與新兇手弗蘭西斯菌的Cpf1。在應用該系統之前，對細菌的基因組進行一次無痕編輯，至少需要一個月，而現在僅需一周的時間便可輕松完成。

圖2 基于Cas9基因編輯的核酸設計方法

Cas9與Cpf1這兩把新型基因組“手術刀”的發現，如同點燃了一條導火線，迅速引爆整個學術圈，基因組編輯工作不再耗時費力，雖然目前也存在一些缺陷，但CRISPR-Cas系統已為“基因組手術”工作進行了強有力的武裝，俗話說“寶刀配英雄”，相信科學家們可利用這套寶刀在科研之路披荊斬棘，創造更多奇迹。

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!