血清使用過程中應注意的問題

　　關于血清使用的幾點建議

　　1、血清必須貯存-20℃，如存放于4℃，請勿超過兩周，對于某些單位一次無法用完一瓶，可在無菌條件下将其40-45ml分裝于無菌50ml離心管中（或血清瓶中），由于血清解凍時體積會增加10％，必須預留此膨脹體積的空間，否則易發生污染或容器凍裂的情形。

　　2、一般公司所提供的血清一般為200ml和500ml裝量，因此建議在使用中宜采取逐步解凍的方法解凍血清：-20℃→4℃冰箱或冷庫溶解24小時→室溫下全溶後再分裝，一般以50ml無菌離心管中分裝40-45ml。使用過程中要特别注意，必須規則地将血清搖晃均勻，小心勿造成氣泡，使溫度與成分均一，減少沉澱的發生。勿直接由-20℃放置至37℃環境下解凍，因為溫度改變太大，溶易造成蛋白質凝結而産生沉澱。

　　3、血清的滅活（heat-inactivation）一般是指56℃，30分鐘水浴加熱已完全解凍的血清，加熱過程中必須規則地搖晃均勻。此處理的目的是使血清中的補體成分（complement）去活化。但是，經過滅活處理的血清會因而造成沉澱的顯著增多，且會影響血清的品質。所以，有的公司所生的細胞培養用牛血清不做滅活處理，由客戶自行選擇。而診斷試劑用血清在除菌過濾前進行過滅活處理。

　　4、在使用血清的時候，勿将血清留置于37℃太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分會因而受到破壞，影響血清的品質。

　　5一般我們在使用過程中是先過濾培養基，再加血清，勿直接過濾血清。

　　6、血清的沉澱物

　　1.凝絮物：其産生的原因有多種，但普遍的原因是血清中的脂蛋白（lipoprotein）變形及解凍後血清中存在的纖維蛋白（fibrin）造成，這些凝絮沉澱物不會影響血清本身的品質。除非必須，如果您想減少這些沉澱物，建議可用離心3000rpm,5min去除，或離心後取上清液加入培養基中一起除菌過濾。

　　2.顯微鏡下觀察“小黑點”，通常經過熱處理的血清，沉澱物的形成會顯著增多。有些沉澱物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為是血清遭受污染（如黑膠蟲），而将血清放置在37℃中欲培養此“微生物”，但37℃環境下，又會使此沉澱物增多，更會誤認為微生物的增殖，但以培養細菌的培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點不會影響細胞的生長。

　　血清質量的決定因素

　　1、關于牛種

　　血清質量與牛種沒有必然的聯系，但有其先天條件。

　　首先，澳大利亞、新西蘭的牛源之所以被國際公認為最好，原因是這些國家的牛源是“無污染”的，“無污染”的實際含義是：病毒等外源因子污染較少。至于美國，由于其國内出現了瘋牛病，其形象由此受到挑戰。這種血清安全性的觀念在發達國家認知度較高，而在我國還不夠重視。

　　其次，牛所能獲得的營養對血清質量有影響。在我國，由于飼養條件的不同，不同地區産的血清質量是有差異的。

　　2、質量标準件的問題

　　我國對人用生物制品生産所用的牛血清制定了國家标準，載于《中國生物制品主要原輔材料質控标準》2000年版，此标準已接近于國外胎牛血清的有關标準。内毒素：國家标準件為不高于10Eu/ml,内控标準件為不高5Eu/ml或10Eu/ml.國家标準之外的質控指标還有：免疫球蛋白、牛腹瀉病毒（BVDV）抗體、激素、和牛源安全性驗證等。

　　3、牛血清的命名和選擇

　　一般公司對細胞培養用牛血清的命名分二類：胎牛血清和小牛血清。對于一般的細胞系，小牛血清可以培養的很好。

　　關于牛血清白蛋白的生産工藝

　　牛血清白蛋白的制備方法有Cohn′s法、鹽析法、熱變性法等多種工藝。不同的生産工藝其産品的名稱、質量指标、應用領域等各不相同。

　　其中Cohn′s法設備、工藝要求比較高，相對應的生産成本較高，但産品質量較好。牛血清組份V（FrationV）就是由Cohn′s法制備的。一般白蛋白純度96-99%、外觀潔白、結晶性狀好、1%蛋白水溶液PH7.0±0.2，再根據不同的應用分成低内毒素、低脂肪酸等等的不産品，主要應用于細胞培養領域的無血清培養基中。鹽析法因生産周期長，純度低和産品聚合體高、穩定性低等缺陷已很少應用。

　　目前國内應用比較普遍的是熱變性法，結合較先進的超濾生産工藝，其工藝要求相對較低，制備成本低，其缺點是目前應用領域比較單一，僅供免疫診斷試劑使用。

　　總結源自：>謝謝分享，請注明來源好帖，頂一下好帖。我說怎麼無論怎麼小心都會有黑點，而且每次PBS洗完後沒有，第二天又有了，終于得到答案了，謝謝了很好,不錯,就是多需要你這樣的人了!liuzeyi2002wrote:

　　5一般我們在使用過程中是先過濾培養基，再加血清，勿直接過濾血清。

　　是過濾培養基（1640），在加血清，然後再過濾

　　還是加入血清後就不用過濾了啊

　　我有我配的凍存液（1640，小牛血清20%，DMSO10%），放在-4度保存好還是-20度保存好啊

　　謝謝，本人最近要凍一批細胞，每次配的話很麻煩，先配好然後直接用，不知道這樣可行iahnilwrote:

　　是過濾培養基（1640），在加血清，然後再過濾

　　還是加入血清後就不用過濾了啊

　　我有我配的凍存液（1640，小牛血清20%，DMSO10%），放在-4度保存好還是-20度保存好啊

　　謝謝，本人最近要凍一批細胞，每次配的話很麻煩，先配好然後直接用，不知道這樣可行

　　你的問題：1.我們是過濾培養基，再加滅活的血清。然後就不用過濾了.

　　2.你凍存液的配方是最老的，7：2：1吧。一般可以這樣配。如果細胞珍貴的話，可以按血清：DMSO，9：1配凍存液。凍存液最好現配現用，！謝謝樓上的！

　　養細胞的過程中，遇到問題的時候還是要從最基本的問題考慮起，例如樓上說的：顯微鏡下觀察“小黑點”，通常經過熱處理的血清，沉澱物的形成會顯著增多。有些沉澱物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為是血清遭受污染（如黑膠蟲），而将血清放置在37℃中欲培養此“微生物”，但37℃環境下，又會使此沉澱物增多，更會誤認為微生物的增殖，但以培養細菌的培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點不會影響細胞的生長。

　　還有就有的細胞本身特性，生長繁殖快，不宜貼壁，比如一些高轉移的腫瘤細胞，往往在培養過程中死細胞，脫落細胞比較多；或者血清的原因等，也會導緻細胞脫落死亡，培養液渾濁，有的戰友可能就會誤認為是污染了。liuzeyi2002wrote:

　　2.你凍存液的配方是最老的，7：2：1吧。一般可以這樣配。如果細胞珍貴的話，可以按血清：DMSO，9：1配凍存液。凍存液最好現配現用，！

　　我凍存的是兒童白血病初診斷時骨髓提取的單個核細胞，老闆讓先凍着，也沒想好做什麼！積累資源

　　能否給點建議，非常感謝一個簡單方法判斷是否有污染，那就是打開培養瓶蓋聞一聞，如果有異味，那就絕對污染了liuzeyi2002wrote:

　　5一般我們在使用過程中是先過濾培養基，再加血清，勿直接過濾血清。

　　請問：1直接過濾血清有什麼弊端？

　　2您用的是進口的血清吧？我們實驗室用的國産血清，不過濾對細胞有影響,可能是因為血清中的有害物質。看了上述各位占有的帖子，我想的是有兩個問題：

　　1，liuzeyi2002戰友說顯微鏡下觀察“小黑點”，并沒有指出小黑點是什麼。請問，那些小黑點到底是什麼？為什麼會出現？是購買血清時就有的（即血清生産過程中就出現），還是購買後存放實驗室的保存原因？？

　　2，ahdongyh戰友說的，在培養過程中脫落細胞比較多；培養液渾濁，被誤認為是污染。

　　我在細胞培養過程中也遇到了類似的問題，請問這些是什麼原因？？為什麼會出現？

　　我也認為是被污染了，我的處理是直接把培養物全部丢棄掉！！

　　感謝您的回答，或者ｐｍ我！！學習了，謝謝xiaowen865wrote:

　　看了上述各位占有的帖子，我想的是有兩個問題：

　　1，liuzeyi2002戰友說顯微鏡下觀察“小黑點”，并沒有指出小黑點是什麼。請問，那些小黑點到底是什麼？為什麼會出現？是購買血清時就有的（即血清生産過程中就出現），還是購買後存放實驗室的保存原因？？

　　2，ahdongyh戰友說的，在培養過程中脫落細胞比較多；培養液渾濁，被誤認為是污染。

　　我在細胞培養過程中也遇到了類似的問題，請問這些是什麼原因？？為什麼會出現？

　　我也認為是被污染了，我的處理是直接把培養物全部丢棄掉！！

　　感謝您的回答，或者ｐｍ我！！

　　我有有這樣的問題，覺得是污染，肉眼看見懸浮的小球一樣的顆粒學習了，謝謝2、一般公司所提供的血清一般為200ml和500ml裝量，因此建議在使用中宜采取逐步解凍的方法解凍血清：-20℃→4℃冰箱或冷庫溶解24小時→室溫下全溶後再分裝，一般以50ml無菌離心管中分裝40-45ml。使用過程中要特别注意，必須規則地将血清搖晃均勻，小心勿造成氣泡，使溫度與成分均一，減少沉澱的發生。勿直接由-20℃放置至37℃環境下解凍，因為溫度改變太大，溶易造成蛋白質凝結而産生沉澱。

　　關于這一點我不認同,應該是直接由-20℃放置至37℃水浴解凍,我沒有看你提供的鍊接.不知你來源是否權威.

　　我們都是用水浴,很好.而且你可能不作臨床不知道臨床是如何應用的,在輸血科,冰凍血漿就是水浴解凍的.當然兩者不同,但是血漿成份更複雜.

　　為了最好的保存活性物質,要用最快的速度解凍.

　　歡迎讨論學習一下了學習了一下，多謝！！上一篇:【讨論】骨髓間充質幹細胞讨論區下一篇:Re:【求助】為什麼tricine-SDS-PAGE中的濃縮膠不凝呢您的位置：醫學教育網>>醫學資料相關内容・關于卡巴斯基離線升級的方法・【medical-news】研究表明:對早産兒進行肺部治療是安全有效的・Re:山東的ggmm聚過來！！（不來要後悔得）・Re:★★★以下帖子已閱★★★・Re:【交流】護士找對象・【求助】慢性非淋美滿黴素最大用量是多少？・Re:心靈雞湯電子版・病人期望對抗生素濫用的影響分析・Re:【求助】腹形癫痫如何診斷和治療・

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