首先是實驗步驟：

1.培養液配置

2.細胞傳代

3.培養液更換

4.細胞凍存

其中最主要的部分就是進行細胞傳代。

什麼是細胞傳代？

1.傳代培養是指将培養物分割成小的部分，重新接種到另外的培養器皿（瓶）内，再進行培養的過程。對單層培養而言，80%彙合或剛彙合的細胞是較理想的傳代階段。

2.傳代培養中的細胞傳代培養（subculture），當原代培養成功以後，随着培養時間的延長和細胞不斷分裂，一方面因細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養物不足和代謝物積累而不利于生長或發生中毒。

為什麼需要進行細胞傳代？

1.增加細胞數量

進行不同環境和條件下的細胞培育試驗，替換不良和壞死細胞，保持細胞活性。

2.防止細胞中毒和死亡

因為細胞會在培養皿中不斷繁殖直到營養物消耗完或代謝物過度堆積，為了保證細胞可以繼續繁殖，需要在細胞密度達到80%-90%的時候進行傳代處理。如果不進行傳代， 細胞會因為培養皿中培養物耗盡， 代謝物過度堆積，ph值降低等問題而中毒和死亡。

3.純化細胞

淘汰培養出來的細胞裡的占比不大的細胞類型，純化最終的細胞類型。

實驗細胞需要怎樣的生存環境？

細胞在體外培養中所需的條件與體内細胞基本相同，需要四項基本條件。

1、無污染環境

無毒和無菌的培養環境是保證細胞生存的首要條件。放置于體外培養的細胞相較于體内細胞丢失了對微生物和有毒物的防禦能力，一旦被污染或自身代謝物質積累等，可導緻細胞死亡。因此在進行培養中，保持細胞生存環境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。

2、恒定的溫度

維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定适宜的溫度。人體細胞培養的标準溫度為36.5℃（±0.5℃），偏離這一溫度範圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比;人體細胞在39-40℃中1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢複;在40-41℃中1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢複;41-42℃中1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個别細胞仍有恢複可能;當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。

3、氣體環境

氣體是人體細胞培養生存的必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，産生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養時一般把細胞置于95%空氣和5%二氧化碳混合氣體環境中。

二氧化碳既是細胞代謝産物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的PH值。大多數細胞的适宜PH為7.2-7.4，偏離這一範圍對細胞培養将産生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環境中更利于細胞生長。有資料顯示，原代羊水細胞培養PH6.8時最适。

細胞培養液PH濃度的調節最常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易逸出，故最适用于封閉培養，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其對細胞的無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變化的特性而用于開放細胞培養技術中，其最大優點是在開放式培養或細胞觀察時能維持較恒定的PH值。

4、細胞培養基

培養基既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生殖增殖的基礎物質，也是培養細胞生長和繁殖的生存環境。培養基的種類很多，按其物質狀态分為半固體培養基和液體培養基兩類;按其來源分為合成培養基和天然培養基。

(1)合成培養基：合成培養基是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的，内含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖能生存但不能很好的生長增殖。

(2)天然培養基：最普遍的天然培養基是血清，其中小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促粘附因子及其多種活性物質,與合成培養基合用，能使細胞順利增殖生長。

具體要細胞傳代要怎麼做呢

實驗前，試劑(培養基，胰酶和PBS)提前30min放入水浴鍋加熱。

實驗盡可能保證無菌操作，用75%乙醇清潔雙手後打開生物安全櫃，所有實驗操作不可離開生物安全櫃使細胞中間的連接斷開方便之後形成單細胞懸液。

備注：單細胞懸液，指把貼壁培養的細胞消化吹打以後形成的懸液。

1. 細胞密度達到80-90%時傳代

2. 準備好：完全培養液、胰酶、PBS（岔開放置，防止污染）。随時用酒精燈燒。準備離心管、不同大小培養皿

3. 吸走舊培養液，加2-3mlPBS沖洗1-3遍，棄PBS

4. 沿壁加1ml0.25%胰蛋白酶（打斷細胞間連接），調槍頭到3ml

5. 在顯微鏡下觀察，當細胞間隙開始變大時，立即加入3ml培養液，終止消化

6. 用槍吸培養液，不同角度垂直吹打，細胞形成的白膜被吹打下來，形成單細胞懸液，收集在離心管中。

7. 900rpm，5min離心重懸，棄上清，可用槍頭吸殘餘液體

8. 加1ml培養液，吹打40次，槍頭不出液面

9. 中皿中加3.65ml培養液；小皿加幾個玻璃片，晃開，再加1.5ml培養液

10. 中皿加350μl離心管中細胞，前後左右晃勻；小皿100-170μl

11. label，放置在培養箱保存

備注：在細胞空隙變多且空隙分散随機，大小均勻時，加培養液停止消化後形成單細胞懸液，收集在離心管中。因為密度不同，細胞最後會沉澱附着在離心管底。配合移液槍去除液體，加入培養液吹打形成新的單細胞懸液，後形成新的一代細胞。

注意：細胞因為老化和在繁殖中的變異，一般隻使用40代，并且在完成操作之後12h内不可劇烈搖晃使新細胞脫離培養皿底。後續實驗中需要小皿，此時在皿底放7-8個玻璃蓋片并且鋪散避免重合，培養液和細胞各加1.5mL和175uL。

除傳代之外，細胞還需要不定期更換培養液來清理懸浮着的死亡細胞和代謝物。

（二）複蘇

1. 液氮凍存處取

2. 擰緊瓶蓋

3. 37℃水浴鍋，劇烈晃動，直至完全溶解，瓶蓋口避免水和手的觸碰

4. 75%酒精充分消毒瓶蓋口

5. 準備10ml離心管，轉移全部細胞，約1ml

6. 加4ml培養基

7. 離心

8. 中皿培養基加4ml

9. 離心的，觀察離心量有多少，少的就不要了

10. 倒掉培養液，用槍頭吸取多餘的液體

11. 從中皿中吸取1ml培養基加入離心管，反複吹打，加入培養基

12. 晃動培養皿，培養箱培養

（三）凍存

1. 傳代離心後

2. 加入1ml凍存液，吹打均勻

3. 放入凍存的瓶子裡

4. -70℃凍存1-2天

5. 之後轉移到液氮罐中

在生物細胞學研究中，有時需要體外培養和分析癌細胞。細胞要養好，就要用好血清，如Ausbian®特級進口胎牛血清，它的内毒素小于3Eu/ml，使細胞更健康，客戶做實驗更加順利。

文章來源于：Heartinker

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