氯黴素因對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有很強的活性，表現出廣譜的抗菌能力，廣泛地應用于動物養殖業。由于它能導緻人體産生再生障礙性貧血和溶血性貧血等毒副作用，歐盟、美國等先後将其定為禁用藥物，不得用于畜牧養殖業中，雖然它們在動物體内殘留量低 ，但毒副作用依然存在。飼料一般是獸藥添加的主要載體，開展飼料中氯黴素測試從源頭進行獸藥殘留控制的有效方法，因此研究配合飼料中氯黴素檢測的方法具有重要的意義。

目前國内外關于組織中氯黴素的殘留檢測方法已很成熟，主要采用酶聯免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜-串聯質聯法。由于飼料的品種較多，組成複雜，使用普通的檢測儀器測定其藥物殘留基質幹擾較大，本文利用液相色譜-串聯質譜的強選擇性和抗幹擾能力特點，建立了飼料中氯黴素殘留的快速定性定量方法，定量限為0.3μg/ kg遠遠低于GB/T 21108-2007規定的限量，對配合飼料生産和畜牧養殖具有指導意義。

一、 實驗部分

1、儀器與試劑

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra ENR串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；C18柱（150mm×3.1mm i.d.,3.5 µm ,Agilent）。

甲醇為色譜純，乙酸乙酯、正己烷、氯化鈉均為分析純，水為去離子水。氯黴素标準品均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥98%，氘代氯黴素（chloramphenicol-D5）購自WITEGA Laboratorien Beelin-Adlershof GmbH公司，用甲醇溶解并配制成1.0㎎/mL标準儲備液，再根據需要稀釋成适當濃度的混合标準工作液，4℃避光保存。

2、樣品前處理

稱取2.00±0.05 g 飼料于50mL 具塞離心管中，加入4 mL水，于渦旋混合器上混勻30 s後靜置10 min待飼料浸潤，加入10 mL氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，v/v ，98：2），于渦旋混合器上快速混勻30 s，超聲波提取10 min；以8000 r/min的速率離心3 min，轉移上層有機溶液至50 mL梨形瓶中，于45℃水浴中減壓濃縮至幹，用1 mL甲醇/水（v/v 2：8）溶解殘留物，加入1 mL正己烷淨化脫脂，離心後取下層，經0.45 µm濾膜過濾，濾液供液相色譜-串聯質譜儀測定。

3、液質聯用儀分析條件

3.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150mm×2.1mm i.d.,3.5 µm ）；進樣量：25μL；柱溫：30℃；流動相：A去離子水，B甲醇；梯度洗脫條件：0～4 min A 70%；4.1～6.5 min A 20%；6.6～8.5 min A 70%；流速：250μL/min。

3.2質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），負離子掃描，噴霧電壓2500V，多反應監測（MRM）方式檢測，

二、 結果與讨論

1、提取條件的優化

氯黴素屬于弱極性物質易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，可以通過這些溶劑提取。乙酸乙酯對氯黴素的提取效率最高，适合于動物組織樣品的提取，又有文獻報道堿化乙酸乙酯對蝦等水産品有更好的回收率。由于配合飼料組成複雜含有大量的脂肪、蛋白質、纖維素、礦物質等複合組分，本研究比較了上述幾種溶劑及堿化乙酸乙酯提取效率，結果表明堿化乙酸乙酯提取效率優于其他幾種常見試劑，實驗對堿化乙酸乙酯的濃度進行優化，實驗表明當乙酸乙酯/25%氨水(v/v,98:2)時提取效率及穩定性最好，随着氨水比例提高提取效率沒有提高，反而對提取的基質幹擾越大；同時飼料樣品的水分很少，在提取前充分潤濕有利于目标物的提取，提高回收率。

2、樣品的淨化

堿化乙酸乙酯提取效率雖高，但提取的非極性脂溶物較多，基質幹擾較大，需要進一步淨化。GB/T 21108-2007和文獻報道的淨化方法用甲醇和4 %氯化鈉溶液溶解目标物，正己烷淨化脫脂兩次，乙酸乙酯進行液-液分配萃取淨化，再過SPE固相萃取柱淨化。本研究的方法：在1 mL甲醇/水（v/v 2：8）溶解殘留物後用1 mL正己烷淨化脫脂，可以有效的去除基質幹擾，省去固相萃取過程，縮短樣品前處理時間。

3、 線性範圍、檢出限和定量限

配制6個不同質量濃度的标準溶液，溶液中氯黴素、為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL ，氘代氯黴素-D5的質量濃度為5.0 ng/mL，在本法所确定的實驗條件下進樣，測定其峰面積，以質量濃度為橫坐标，峰面積的比值(氯黴素峰面積/氘代氯黴素-D5 面積)為縱坐标，繪制标準曲線，回歸方程、相關系數。在空白配合飼料基質中添加氯黴素标準品，以信噪比（S/N）≥3時的含量定為方法的檢出限（LOD）；以信噪比（S/N）≥10時的含量定為方法的定量限（LOQ），氯黴素的檢出限和定量限，其相應的MRM色譜圖，标準溶液的MRM色譜圖。

4、 回收率和精密度

選取陰性配合飼料樣品，添加氯黴素标準品和内标，氯黴素标準品添加水平為0.3 μg/ kg、1.0 μg/ kg、5.0 μg/ kg，氘代氯黴素-D5 5.0 μg/ kg，每個添加5次平行，回收率平均在89.7%-105.6%之間，相對标準偏差(RSD)小于8.7% 。

三、 結論

本文建立了配合飼料中氯黴素測定的高效液相色譜-串聯質法。串聯質譜和同位素内标的使用消除了配合飼料複雜基質的影響，提高定量的準确性。該方法操作簡便，省去固相萃取步驟，縮短檢測周期，靈敏度較高，回收率較好。

作者：魏雲計

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