1.什麼是細胞全能性？

  細胞全能性（celltotipotency）比較權威的定義是1984年國際組織培養協會做出的：“細胞全能性為細胞的某種特征，有這種能力的細胞保留形成有機體所有細胞類型的能力”。這個定義比一般所說的概念“一個細胞中包含着這種生物的全部遺傳信息（基因），在适當的條件下可以發育成一個完整的生物體”更基本和全面。它不但包含了培養細胞再生成植株的情況（分化成各種類型的細胞，并以一定形式構建成植物），同時也包含了培養細胞生産次生代謝物的情況（不分化或隻分化成某種類型細胞，但仍留着分化為其他細胞類型的能力）。前者成為組織培養和轉基因植物需要進行植株再生的理論基礎，後者成為像微生物發酵一樣培養細胞，生産人們所需要的次生代謝産物的理論基礎，如通過紅豆杉的細胞培養生産紫杉醇。

  2.植物組織培養技術是如何發展起來的？

  技術和理論是一對孿生兄弟，相輔相成，技術手段的發明會促進理論的創新，理論的創新又會指導技術的實踐活動。植物組織培養也是如此。

  早在1902年，哈伯蘭特（Haberlandt）提出高等植物的器官和組織可以不斷地分割，直至單個細胞的觀點，預言植物體細胞在适宜的條件下，有發育成完整植株的潛力，提出了植物細胞全能性的設想，并且用植物細胞組織進行了培養實驗。他雖然未能獲得再生植株，卻是植物組織培養的開創者。1902年他發表了著名論文《植物細胞離體培養實驗》，論文中提出的植物細胞全能性的理論是植物組織培養的理論基礎。

  從哈伯蘭特提出植物細胞全能性的理論，到1958年斯圖爾德（F.C.Steward）等人第一次用胡蘿蔔根的韌皮部細胞證實了植物細胞的全能性，用了整整56年。56年中許多科學家做的事情歸納起來都是在探索哈伯蘭特提出的“植物細胞在适宜條件下，有發育成完整植株的潛力”中的适宜條件。

  20世紀60年代以後，植物組織培養進入了迅速發展階段，并逐步走向生産應用，如快繁脫毒、單倍體育種、種質資源保存、生産次生代謝産物等，也為人工種子、細胞融合、轉基因植物等奠定了基礎。

  3.怎樣制備胡蘿蔔培養基（供參考）？

  （1）誘導胡蘿蔔愈傷組織

  在MS培養基［注］中加入質量分數為0.5mg/L的6-BA和質量分數為0.5mg/L的NAA

  （2）誘導胡蘿蔔叢芽

  在MS培養基中加入質量分數為2mg/L的KT和質量分數為0.2mg/L的NAA

  （3）誘導胡蘿蔔生根

  在1/2MS培養基中加入質量分數為0.1mg/L的NAA

  ［注］：MS培養基的配制方法見《選修1附錄3中八》。

  4.植物組織培養中的愈傷組織是如何形成及再分化的？

  植物組織培養中使用的外植體一般是高度分化了的細胞，在植物體中是不會再分裂繁殖的，隻是執行某種功能直至死亡。這些細胞在培養基上培養時會由原來的分化狀态，變成分生狀态的細胞，分裂産生愈傷組織，這個過程稱為脫分化（dedifferentiation）過程。這種轉變在細胞的形态結構和生理生化上都會産生一系列變化。組織培養的研究結果表明分化細胞的脫分化需要兩個條件，即創傷和外源激素。

  目前人們對于脫分化過程的本質還不清楚。分化細胞在細胞周期中是處于一種相對靜止狀态的細胞（G0期細胞），脫分化是要打破這種狀态，使細胞進入細胞周期中的G1期，并沿着G1期→S期→G2期→M期的循環進行細胞分裂，形成愈傷組織。現在發現細胞周期受基因調控，一種稱為編碼細胞周期依賴性激酶CDK（cycilindependentkinase）的基因和一種細胞周期蛋白（cyclin）可能與植物細胞脫分化的第一次分裂啟動有關。那麼，什麼因素誘導細胞周期調控基因的作用，培養實踐證明與外源激素有關。至于激素如何誘導以及誘導作用的過程目前仍不清楚，有待深入研究。分化細胞脫分化後細胞結構有兩點明顯的變化：一是在細胞内出現液泡蛋白；二是葉綠體轉變成原質體。

  當細胞脫分化形成愈傷細胞後，經過一段時期的分裂，細胞群體變成不是一種細胞類型的均一群，又會産生分化，形成分生細胞或分生細胞團，由此再生成植株有兩條途徑：一是形成體細胞胚（功能類似于受精過程産生的胚），通過體細胞胚形成再生植株。二是走器官發生的途徑再生植株，分生細胞在一定的誘導條件下重建芽的分生組織，分化出芽後再生根，成為完整的植株。

  5.為什麼要在避光條件下培養愈傷組織？

  對于植物組織培養來說，光照條件非常重要，包括光照強度、時間和波長。但在愈傷組織的誘導階段往往要暗培養，而在分化再生的過程中一定要有光照。愈傷組織誘導階段的暗培養有利于細胞的脫分化産生愈傷組織，如果在光照條件下容易分化産生維管等組織，不利于産生大量的愈傷組織。

  6.什麼是人工種子？

  人工種子（artificialseed）是指通過植物組織培養的方法獲得的具有正常發育能力的材料，外面包被着特定的物質，在适宜的條件下可以發芽成苗的植物幼體。人工種子的概念中包含的“具有正常發育能力的材料”通常是指胚狀體（目前國外有使用不定芽、頂芽和腋芽的），它可以由三種途徑産生：

  （1）由已脫分化的外植體直接産生；

  （2）由愈傷組織産生；

  （3）由懸浮細胞培養産生。對胚狀體的基本要求是：①播種後能快速出苗；②根和芽幾乎同時生長，不産生愈傷組織；③同步化程度高；④活力強；⑤形成的幼苗的形态與生長要常。

  “外面包被着特定的物質”是指人工種皮，制作人工種皮的材料有海藻酸鈉、明膠、樹脂、瓊脂糖、澱粉等。對人工種皮的要求是：能保持胚狀體的活力，有利于貯藏運輸和萌發。選取的材料要有韌性，耐壓，對胚狀體無毒害，含有胚狀體發芽所需要的營養成分或植物激素，還應含有殺菌劑，以防播種後微生物的侵害。

  人工種子目前還存在不少問題。例如，現有重要經濟價值的植物産生胚狀體能力弱，難以形成同步化的有強活力的胚狀體；成本較高；運輸貯藏以及機械化播種問題也未解決。因此，現在很少有人以生産為目的進行人工種子的研制。

  7.植物微型繁殖技術高效快速的實例有哪些？

  植物脫毒（virus-free）和離體快繁（invitropropagation）是目前植物組織培養應用最多、最有效的方面。生産上許多無性繁殖作物均受到病毒的侵染，從而導緻品種的嚴重退化、減産和降低品質。利用植物分生組織進行培養可以使新長成的植株脫去病毒。利用這種方法生産無病毒苗的農作物有馬鈴薯、甘薯、大蒜、草莓、蘋果、香蕉等，并已大規模應用于生産。離體快繁技術可以使一些植物的擴增速度比常規方法快數萬倍乃至百萬倍，而且産生的幼苗遺傳背景均一，重複性好，不受季節和地區限制。目前世界上已建成很多年産百萬苗木的組培工廠，成為一種新興産業。離體快繁技術在觀賞植物、園藝植物、經濟林木和無性繁殖作物上已得到廣泛應用。

  8.植物體細胞雜交的過程是怎樣的？

  體細胞雜交是克服植物有性雜交不親和性、打破物種之間的生殖隔離、擴大遺傳重組範圍的一種手段。操作過程包括：原生質體制備、原生質體融合、雜種細胞篩選、雜種細胞培養、雜種植株再生以及雜種植株鑒定等步驟。

  原生質體制備是用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶将植物細胞壁分解掉，隻留下細胞膜（質膜）包裹着細胞内含物。原生質體融合是指兩個原生質體的質膜重新組合排列形成一個質膜，其中含有兩個細胞核。在細胞工程中一般是誘導融合，形成的融合細胞中所含有的兩個細胞核是來自不同的物種，稱之為異核體（heterokaryon）。誘導融合的手段有化學誘導和物理誘導。在誘導因素的作用下形成的融合細胞進一步産生核融合，進行第一次有絲分裂。雜種細胞的篩選方法有：①細胞系互補的選擇方法，包括葉綠素缺失互補、營養缺陷互補和抗性互補等；②利用物理特異性差異的選擇方法：這是利用兩個原生質體物理特異性差異的一種選擇，包括原生質體的大小、顔色、浮密度等的不同來選擇；③利用生長特異性差異的選擇方法。需要注意的是上述選擇方法隻适合部分雜交細胞的情況，有時無法選擇，就不加選擇地進行培養和再生成植株，然後對再生植株的雜種性狀進行鑒定。雜種細胞培養方法與原生質體的培養方法相似。體細胞雜種的鑒定方法有：①形态學鑒定。利用雜種植株與雙親在表現型上的差異進行比較分析，如葉片大小與形狀，花的形狀與顔色、葉脈、葉柄、花梗及表皮毛有無等；②細胞學鑒定。雜種植株細胞中的染色體數目是否比任何一方親本細胞中的染色體數目增多？理論上講如果染色體不丢失，雜種細胞中染色體數目應為雙親染色體數目之和。也可以用基因組原位雜交的分子細胞學方法進行鑒定；③同功酶鑒定。同功酶是功能相同的酶的多重分子形态，它們是特異基因的産物。雜種細胞中的同功酶譜一般是雙親酶譜之和，但有時也會出現雙親沒有的新帶；④分子生物學鑒定。常用的方法有限制性片段長度多态性（RFLP）、随機擴增多态性（RAPD）和擴增片段長度多态性（AFLP）等。

  值得注意的是體細胞雜交尚存在一些問題：①親緣關系越遠，染色體排斥丢失的現象就越嚴重；②由于是兩個物種的全部遺傳物質的合并，各種基因都在其中，選擇符合需要的個體難度大；③有時缺乏選擇雜種細胞的有效方法。因此目前整體對稱融合的工作比較少，而是采用非對稱融合，即一方親本包括了全部遺傳物質，另一方親本隻取一部分遺傳物質，如用不具有核的原生質體與之進行融合。

  9.物理和化學方法誘導原生質體融合的基本原理是什麼？

  化學融合的機制：常用化學融合方法有高pH—高Ca2 法和聚乙二醇（PEG）法。高pH—高Ca2 法誘導原生質體融合的基本原理是中和原生質體表面所帶的電荷，使原生質體的質膜緊密接觸，從而有利于質膜的接觸融合。PEG處理原生質體可以使原生質體聚集促進融合，但PEG誘導融合的真正機制目前并不清楚。

  物理融合的機制：常用方法為電融合法。此法是先将兩種原生質體以适當的比例混合成懸浮液，将其滴入電融合小室中，給小室兩極以交變電流，使原生質體沿電場方向排列成串珠狀，接着給以瞬間高強度的電脈沖，使原生質體膜産生局部破損而導緻融合。

  10.工廠化生産人參皂甙的基本過程是什麼？

  第一步，選擇人參根作為外植體進行培養，産生愈傷組織，經過培養選擇找到增殖速度快而且細胞内人參皂甙含量高的細胞株作為種質，其中一部分作為保存用，以備下一次生産用，一部分進行發酵生産。

  第二步，将第一步選擇到的細胞株在發酵罐中的适合培養液中進行液體培養，增加細胞數量。

  第三步，将發酵罐中培養的細胞進行破碎，從中提取人參皂甙。歡迎關注中學高分寶典

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