測定蛋白質濃度的方法有很多，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法，雙縮脲法，BCA方法，Lowry法，考馬斯亮藍法，凱氏定氮法等等 ，今天小編以UV法，BCA法，考馬斯亮藍法，其中的三種方法的測定蛋白質濃度的原理、優缺點、操作以及注意事項做詳細介紹。

UV法

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，将吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白 質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，适合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受 到平行物質的幹擾，如DNA的幹擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

（1）簡易經驗公式 蛋白質濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

（2）精确計算 通過計算OD280/OD260的比值，然後查表得到校正因子F，再通過如下公式計算最終結果：

蛋白質濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d為測定OD值比色杯的厚度

D為溶液的稀釋倍數

方法二：試管法

1. 配制工作液：根據标準品和樣品數量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制适量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應。每個測定要做 2～3 個平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規格不同，體系需要放大到實驗将采用的比色杯準确讀數所需要的體積。

2. BSA 标準品和樣品的準備：樣品用水或其它不幹擾顯色反應的緩沖液配制，使待測定的濃度位于标準曲線的線性部分。每個反應準備 3 個平行測定。标準曲線一般 5~6 個點即可。根據樣品的估測濃度确定各點的具體濃度。稀釋 BSA 時可以用水或與樣品一緻的溶液。如待測樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标準品、樣品及 BCA 工作液。

3. 取适量體積的标準蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

4. 将樣品與标準品在 562 nm 波長下測定吸光度。

考馬斯亮藍法

實驗原理 考馬斯亮藍 (Coomassie Brilliant Blue) 法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質測定法之一。

考馬斯亮藍 G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變為 595 nm，溶液的顔色也由棕黑色變為藍色。通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結合。

突出優點 （1）靈敏度高，據估計比 Lowry 法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達 1 mg。這是因為蛋白質與染料結合後産生的顔色變化很大，蛋白質-染料複合物有更高的消光系數，因而光吸收值随蛋白質濃度的變化比 Lowry 法要大的多。

（2）測定快速、簡便，隻需加一種試劑。完成一個樣品的測定，隻需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約隻要 2 分鐘即可完成，其顔色可以在 1 小時内保持穩定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顔色的穩定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費時和需要嚴格地控制時間。

（3）幹擾物質少。如幹擾 Lowry 法的 K 、Na 、Mg2 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不幹擾此測定法。

缺點 （1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作标準曲線時通常選用 g-球蛋白為标準蛋白質，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質幹擾此法的測定，主要的幹擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。

試劑與器材 1、試劑 考馬斯亮藍試劑：

考馬斯亮藍 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。

2、标準和待測蛋白質溶液 （1）标準蛋白質溶液

結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。

（2）待測蛋白質溶液。 人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。

3、器材 試管 1.5×15 cm（×6），試管架，移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計。

操作方法 一、制作标準曲線 取 7 支試管，按下表平行操作。

搖勻，1 h 内以 0 号管為空白對照，在 595 nm 處比色。

繪制标準曲線：以 A595 nm 為縱坐标，标準蛋白含量為橫坐标，在坐标紙上繪制标準曲線。

二、未知樣品蛋白質濃度測定 測定方法同上，取合适的未知樣品體積，使其測定值在标準曲線的直線範圍内。根據所測定的 A595 nm 值，在标準曲線上查出其相當于标準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度（mg/mL）。

注意事項 （1）在試劑加入後的 5-20 min 内測定光吸收，因為在這段時間内顔色是最穩定的。

（2）測定中，蛋白-染料複合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完後可用乙醇将藍色的比色杯洗幹淨。

（3）利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正确使用，重複測定吸光度時，比色杯一定要沖洗幹淨，制作蛋白标準曲線的時候，蛋白标準品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。

文章來源：每日生物評論，每日生物評論

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