在qPCR擴增實驗室中，相信大家也經常遇到這種情況：我們使用試劑A同時擴增體系1和體系2，體系1得到的擴增結果明顯優于體系2；但是，如果換用同類型試劑B對體系1和體系2進行擴增，體系2得到的擴增結果反而更好。

這是巧合還是有規律可循？擴增試劑難道對不同體系有不同的适配性？不亂猜了，讓我們拿實驗數據說話！這裡，小編以不同GC含量模闆為變量，使用探針法熒光定量PCR的方法進行一探究竟！

說到這裡，有人該問了，GC含量不同是什麼意思呢？不要着急，小編來解答：首先，GC含量是指在核酸序列中，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率，又稱為G C比值或GC比值，用公式可以表示為：[（G C的總數量）/（A T C G的總數量）] * 100%。小編本次實驗就是圍繞不同GC含量的DNA序列為擴增模闆展開的。

圖1. GC堿基對的配對性質（圖片源自網絡，侵删） 圖1. GC堿基對的配對性質（圖片源自網絡，侵删）

一般地，擴增模闆GC含量會控制在40%~60%，最佳為45%-55%。GC含量超出範圍值，就會對特異性擴增造成阻礙。高GC片段一般指DNA中GC含量高于60%的片段；低GC片段則指DNA中GC含量低于40%的片段。

那麼，針對GC含量不同的體系，我們使用3款探針法熒光定量專用預混液進行比對測試，每個體系測試3個複孔。以平均CT值為檢測指标，判斷檢測試劑的擴增效率。比較平均CT值和熒光終點，CT越小，檢測效率越高，若△CT值在±0.5以内，認為靈敏度無顯著差異。結果如下：

※ 在兩個普通GC含量（53.5%、50.6%）體系中實驗結果如下：

圖2. 普通體系擴增結果示意

結果說明：在兩個普通體系下，3款試劑的擴增效率無顯著差異（兩兩比較，△CT值均在±0.5以内），但是，從擴增曲線中可以很明顯地看出，試劑A的熒光終點顯著高于其他兩款試劑，說明在普通體系中，試劑A相比于其他兩款試劑有較高的适配性。

※ 在4個高GC（62.30%、67%、68.4%、63.1%）體系中實驗結果如下：

圖3. 高GC體系擴增結果示意

結果說明：在4個高GC體系中，三款試劑的擴增表現出較大差異：試劑B相較于其它兩款擴增試劑CT值較小，且達到顯著差異，而其它兩款試劑CT值不存在顯著差異；在擴增曲線中，試劑B也呈現出較高的終點熒光，因此，試劑B具有較好的高GC體系适配性。

※ 在4個低GC（34%、35.5%、38.8%、38.1%）體系中實驗結果如下：

圖4. 低GC體系擴增結果示意

結果說明：在4個低GC體系中，三款試劑的擴增表現出較大差異：相較于試劑B，從△CT值和擴增曲線熒光終點來看，試劑A和試劑C均表現出較好的擴增優勢，且試劑A和試劑C之間無顯著差異。

綜合以上結果，不難看出，三種試劑對于不同GC含量體系的适配性是不同的。在普通體系中，試劑A檢測效率優于其他兩款試劑；在高GC體系中，試劑B整體檢測效率更優；而在低GC體系中，試劑B整體檢測效率不如試劑A和試劑C。因此，試劑B更适配于高GC體系，正如文章開頭中提到的困擾大家的問題，很顯然，這是不同試劑适配體系不一緻導緻的。

為什麼會出現這種情況呢？

小編“翻箱倒櫃”，才恍然大悟。首先，高GC作為擴增途中的大型“攔路虎”，具體到擴增的三個階段，高GC含量PCR擴增的難點在于：

1.難變性：DNA模闆在常規變性溫度下，解鍊不完全；

2.難退火：由于DNA模闆形成的二級結構，退火時引物不易與模闆結合；

3.難延伸：由于DNA模闆形成的二級結構，使PCR産物的延伸效率大幅下降[1]。

圖5. 基于抗體法修飾酶的熱啟動PCR擴增三部曲（圖片源自網絡，侵删）

為了增加高GC靶片段的擴增特異性和産量，一般會有各種優化方式。除了适當提高變性溫度、調整模闆等關鍵反應要素的濃度之外，對于擴增試劑本身來講，添加增效劑（如甜菜堿、二甲基亞砜(DMSO)、甲酰胺、甘油、吐溫-20等）是消除複雜的二級結構、獲得大量高GC體系特異性擴增産物的有效途徑[2]。但是由于增效劑的濃度不好把控，應用在其他體系中，很有可能會造成較大的擴增抑制[3]，因此，就出現了不同擴增試劑适配不同體系的最終結果。

諾唯贊作為服務于動物疫病檢測等領域專業的産品和解決方案供應商，立足于酶學技術創新，結合大量驗證實驗，開發出适配于不同GC含量體系的檢測試劑，幫助大家減少體系開發周期，獲得性能更優的檢測試劑。

【參考資料】

[1] 張争, 張楊, 徐進, 等. 高GC含量青枯菌aac基因PCR擴增體系的建立與優化[J]. 植物保護, 2008(02): 90-93.

[2] 高梅, 劉樹人, 李強, 等. 高GC含量DNA序列PCR擴增的引物設計[J]. 華南國防醫學雜志, 2014, 028(007): 633-638.

[3] Zheng Z, Yang Z, Jin X, et al. Establishment and optimization of the PCR system for amplification of aac gene from GC-rich Ralstonia solanacearum[J]. Plant Protection, 2008.

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