近日，中國農業大學園藝學院韓振海、李威團隊在國際知名雜志《植物生理》（Plant Physiology）發表了題為《基因編輯蘋果SQUAMOSA PROMOTER BINDNG PROTEIN-LIKE 6提高不定芽再生效率》（Genome editing of apple SQUAMOSA PROMOTER BINDNG PROTEIN-LIKE 6 enhances adventitious shoot regeneration）的研究論文。該研究成功利用基因編輯技術突變蘋果MdSPL6基因，顯著提高不定芽的再生效率，為在蘋果和其他薔薇科果樹中利用基因編輯技術創制高再生種質探索出一條有效途徑。

論文信息

在蘋果中建立高效的轉基因及基因編輯技術體系是實現分子設計育種的關鍵。然而，多數蘋果品種和砧木材料遺傳轉化效率普遍偏低，嚴重限制了分子遺傳改良進程。不定芽再生能力低是蘋果遺傳轉化的主要瓶頸。挖掘适用于蘋果的再生基因，提高不定芽再生能力，是建立蘋果高效遺傳轉化體系的重要基礎。

論文插圖

該研究首先通過多組學聯合分析和遺傳轉化實驗揭示蘋果 ‘GL-3’ 材料高再生的分子機制，發現miR156aa的高表達是其再生能力強的主要原因；進而通過WGCNA分析和雙熒光素酶實驗驗證miR156aa對不定芽再生的調控是通過靶向調控MdSPL6實現的，并結合遺傳轉化實驗證實MdSPL6對不定芽再生的抑制作用。進一步在蘋果MdSPL6基因編碼區設計2個基因編輯位點，利用農杆菌介導法進行遺傳轉化實驗，成功獲得蘋果Mdspl6突變株系。通過對突變體材料進行不定芽再生能力檢驗，證實葉片再生能力顯著增強。

此前，美國佛羅裡達大學霍合強團隊在Plant biotechnology journal期刊上在線發表了題為“Application of Developmental Regulators to Improve In-Planta or In Vitro Transformation in Plants”的研究論文，該研究利用過表達影響植物再生發育相關的基因，通過農杆菌體外注射成株或者侵染外植體離體再生的方法成功地在金魚草，番茄，小白菜等多個物種上獲得了穩定的轉基因植株，這種高效的轉基因手段對于基因編輯和其它植物技術在現代農業的運用上具有重要的運用價值和意義。

随着基因編輯和基因組測序技術的不斷發展，轉基因成為了研究基因功能和現代化植物育種中一種必不可少的技術手段，但是受限于不同物種的再生能力，缺乏高效的遺傳轉化體系限制了現代生物技術在許多重要作物物種上有效應用。在本研究中，研究者首先在金魚草成年植株上注射了調控植物再生發育相關基因的過表達載體，包括PLETHORA (PLT5)， WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1 (WIND1)，ENHANCED SHOOT REGENERATION (ESR1)， WUSHEL (WUS), 和 WUS-P2A-BBM在内的5種不同的拟南芥再生發育相關基因，結果發現注射過表達PLT5, WIND1 和WUS 可以直接得到能夠穩定遺傳的轉基因再生芽，其中PLT5有着最高的轉化效率，這一結論在番茄上得到了進一步驗證。同時，研究者發現過表達PLT5也可以顯著提高離體小白菜子葉的遺傳轉化效率。此外，研究者在農杆菌過表達載體中加入了GFP 和Dellia (促進花青素合成的轉錄因子)過表達元件, 在方便了轉基因植株篩選工作的同時，也進一步證實了方法的有效性。

圖一 金魚草成株注射遺傳傳化試驗

圖二 番茄成株注射遺傳轉化試驗

研究中的轉基因方法有着以下兩點優勢：1) 可以提高再生能力比較差的物種的遺傳轉化效率，此外成株體外直接注射轉化的方法可以跨過繁瑣的組培工作，在野生型植株上直接收獲T1代轉基因種子，極大的縮短了轉基因材料的獲得時間，尤其适合于一些生長周期較長的物種；2) 體外注射轉化可以直接得到轉基因枝條和野生型母株的結合體，有助于分子信号長距離運輸傳導的研究。

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