在做western blot之前，我們收集的組織、細胞等樣品可能很珍貴，抛棄不同大小的蛋白要耗費很多樣品，所以一般我們要進行蛋白定量，一般我們使用BCA定量試劑盒，市面上有很多Commercial試劑盒，效果都不錯。但是如何又快又準定量蛋白，這裡還是有點小竅門的，今天，醫學方小編就給大家分享一下BCA蛋白定量的技巧。

一、實驗原理

首先，我們先了解下BCA蛋白定量的原理。BCA蛋白濃度檢測是根據吸光值可以推算出蛋白濃度。堿性條件下，蛋白将Cu2 還原為Cu ， Cu 與BCA試劑形成紫顔色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與标準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響，可以兼容樣品中SDS， Triton X-100， Tween20、60、80。但一般受螯合劑EDTA和略高濃度的還原劑的影響，需确保EDTA低于10mM，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。不适用BCA法時建議使用Bradford蛋白濃度測定。BCA操作簡單，快速，45分鐘内完成測定，準确靈敏，試劑穩定性好，BCA試劑的蛋白質測定範圍是20-200μg/ml，微量BCA測定範圍可在0.5-10μg/ml。經濟實用，除試管外，測定可在微闆孔中就進行，大大節約樣品和試劑用量；抗試劑幹擾能力比較強，如去垢劑，尿素等均無影響。

二、實驗器材

（1）可測562nm吸光度的96孔闆酶标儀 ，透明底96孔闆（2）恒溫箱

（3）天能VE586（4） 若幹15ml離心管，1.5ml EP管 （5） 槍式移液管

三、實驗步驟

一般BCA定量試劑盒由試劑A，B和BSA組成

1. 試劑準備：

根據樣品數計算出所需要BCA工作液的總體積，一般96孔闆，每個樣品大于等于2複孔，标準曲線大于等于五個點即可。

BCA工作液的總體積=（标準曲線點數 樣品數）*重複次數*200ul BCA工作液體積

2. 根據算出BCA工作液的總體積，取體積比為 試劑A：試劑B=50:1，混勻，制成BCA工作液。

3. 制作标準曲線樣品，不同人有不同方法，這裡，小編的方法是倍比稀釋法，以下為兩複孔為例。配置2mg/ml BSA, 準備5個1.5ml EP管，标記1-5号，加入50 ul的1*PBS。取2mg/ml 100ul，分别依次加入50 ul EP管中倍比稀釋，5号管隻是50ul 1*PBS使得五個EP管中最終BSA濃度為2 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.25 ug/ml, 0.125 ug/ml，0 ug/ml， 混勻，加入96孔闆每孔20ul，2複孔。

4． 待測樣品吸取10 ul 40 ul 1*PBS稀釋五倍而成，96孔闆每孔20ul，2複孔。

5. 每孔加入200ul 制備好的BCA工作液，将96孔闆放置在60℃恒溫箱 30min。

6. 稍微冷卻後，拿去闆蓋，放入酶标儀上測出每孔A562值，就是樣品在562nm處的吸光度。

7. 計算所有兩個孔稀釋液A562的平均值。

8. 以BSA标準樣品對應蛋白濃度為橫坐标x，以相應A562平均值為縱坐标y， 在Excel中拟合标準曲線，得到二元一次方程式y=ax b，R2越接近1最好，小數點後起碼兩個9。

9. 将樣品的A562代入y=ax b方程即可算出樣品的濃度，我們樣品稀釋五倍，最後濃度乘以5即可。

10.VE-586 轉移電泳槽是用來對少量核酸及蛋白質樣品進行轉移電泳的裝置。專用開啟式轉移膠架，操作簡便。配備兩塊槽内藍冰盒，可提前預冷置于槽内，在轉移電泳過程中起降溫作用，冰盒可反複使用，方便環保。創新設計，同時可以轉印四塊凝膠，做到一槽多用，可節省實驗空間和經費。

性能特點

槽體采用高強度和高透明度的聚碳酸酯材料注塑成型，免除液體滲漏的困擾。

多重安全設計，免除了可能産生的操作安全問題。

安全按鈕式的開蓋設計，方便電泳槽蓋的開啟。

專用開啟式轉移膠架，操作方便。

可同時轉印四塊9×9cm凝膠

專用藍冰盒可反複使用，方便環保。

轉印時間為15-60min，也可選擇低電壓過夜。

可以與VE-680微型垂直電泳槽配套使用

流行外型設計，精品理念，超越國外同類産品同樣水平。

四、注意事項

（1）試劑A, B液一般在4℃保存，用前先搖勻，放置久了會有沉澱。

（2）BCA工作液一定要現用現配。

（3）樣品要稀釋或濃縮到标準曲線範圍之内，太稀太濃是沒有什麼意義的。

（4）BCA法非常容易受到高濃度還原劑的影響，制備樣品時候要排除DTT，β-巯基乙醇對于蛋白定量影響。

好了，今天小編教給大家如何快準狠定量蛋白樣品，讓你不再浪費寶貴的樣品，在接下去的實驗遊刃有餘，例如Western blot實驗。

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