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westernblot原理及應用

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原理：

蛋白質免疫印迹（Western Blot）是用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術。電泳分離後的蛋白質從凝膠轉移到固相載體（如PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變，以其作為抗原，與對應的第一抗體起免疫反應，再與酶或同位素标記的第二抗體反應，經過底物顯色或放射自顯影，通過觀察着色的位置和着色深度等，可獲得蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況及蛋白成分等信息。

關于蛋白提取：

1. 裂解buffer：每種裂解buffer都有其擅長的用途，市面上常見的裂解buffer見下表：

Tips：

除了這些裂解buffer以外，為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的；在提取蛋白的時候僅僅靠裂解液有時候也不能達到完全抽提的效果，有條件的話，可以對抽提懸液進行10-20s的超聲破碎處理；此外如果沒有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替來抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過抽提後的樣本不能進行濃度測定。

2. 幹擾蛋白：培養細胞、動物組織都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白與免疫球蛋白，這些蛋白會經常性的出現雜帶幹擾，一般白蛋白雜帶在70kDa處，免疫球蛋白雜帶出現在50kDa處；有人懷疑：“我的抗體也不識别這些蛋白啊！”，現實不是這樣的，當某種蛋白含量超過一定量的時候，即使很少的非特異吸附都有可能造成信号的富集而造成雜帶；建議廣大戰友在提取細胞蛋白的時候，一定要使用PBS漂洗細胞至少3次，去除殘留的培養基成分；提取組織的時候，盡量去除組織中血液的殘留，這樣樣本中的幹擾因素才會減少到最低。

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關于膠濃度及電泳條件的選擇：

正确選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區域最大限度的分離開，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降到最低；膠濃度及電泳條件的選擇見下表：

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關于轉膜的條件與注意事項：

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轉膜條件：

對于分子量10-15kDa的指标轉膜時間不宜過長，100V、冰浴45min足矣；對于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足夠了；其他介于15-150kDa之間的指标100V、冰浴1h完全可以保證效果。

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轉膜操作：

準備PVDF膜的大小要與切割後的凝膠大小一緻或略小，濾紙和海綿大小也要一緻；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使膠變形，條帶彎曲，太薄氣泡容易進入，導緻條帶不完整，這些都可以用增加減少濾紙量來改善；一定要把目的蛋白分子量區域貼在膜的中間部位；分清楚正極與負極，避免反方向轉印；轉印緩沖液要提前預冷，整個轉印過程也需要在冰浴中進行。

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關于分子量實際與預測結果的差異：

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預染marker的誤差：

由于預染marker是由标準蛋白與有色染料偶聯而成的，所以偶聯後的蛋白由于表面結構的改變，導緻在SDS-PAGE中分離的線性關系沒有天然蛋白那麼好；另外由于偶聯的批次不同，每個條帶針對每個批次呈現出的分子量會有些許的變化，所以在使用預染marker的時候，出現5-10%的分子量誤差是不能避免的，如果需要确切分子量需要用非預染marker來标定；

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物種差異：

很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的長度并非完全一緻，具體問題還要具體分析；

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蛋白本身的性質：

①分子量數值僅僅是一個氨基酸數值累加的相對值，與實際值本身存在差距；

②蛋白質存在磷酸化、乙酰基化、糖基化等翻譯後修飾可導緻分子量增大，比如常見的CD家族蛋白糖基化修飾以後分子量都會增大許多；

③蛋白質存在翻譯後酶前體狀态與激活剪切狀态，可使分子量變小，比如MMP2蛋白，酶源與激活态大小分别是72kDa、63kDa；

④蛋白質存在多個轉錄本由一個基因編碼的形式，不同的轉錄本翻譯得到的蛋白分子量不一樣，比如JNK這個蛋白，本身分為JNK1，JNK2，JNK3三個亞型，三種亞型同源性較高，而且針對每個亞型還有不同分子量的轉錄本呈現；要想正确把握蛋白分量問題不僅僅要讀說明書，還要關注這個蛋白的相關背景知識；

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關于封閉

封閉也是Western中比較關鍵的環節，一般常規的條件是5%脫脂奶粉溶于1×TBST中，常溫下搖床緩慢搖晃，封閉1h；除此之外還需要向大家介紹另外一種封閉液—0.5% 明膠，這兩種封閉液都适用于常規的Western實驗，他們之間的取舍關系可近似認為，如果用脫脂奶粉封閉結果是“白闆”或者信号較弱，可以考慮換明膠；如果用明膠封閉，結果雜帶較多，背景較深可以考慮用脫脂奶粉；甚至有的時候兩者可以混合起來使用，具體的細節需要大家在實驗中細細品味。

在Western Blot實驗中通常需要注意以下幾個問題:

1. 免疫印迹雜交的敏感與檢測系統有關.因此,凝膠電泳時的蛋白上樣量應該保證被檢測抗原量不至于太低,如果過低應該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋,上樣電泳後,直接考馬斯亮藍染色選擇最佳上樣量,純化和濃縮的蛋白質樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析。

2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度适當,不僅可以決定凝膠聚合的速度,也将影響凝膠的質量,聚膠時的溫度也将影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據不同溫度下适量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現凝膠凝聚的時間為15-20分鐘最佳,對于濃縮膠最佳聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結合。

3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性,操作時應該戴手套防護.梳子插入濃縮膠時,應确保沒有氣泡,可将梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的産生,梳子拔出來時應該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠内。

4. 電泳槽内加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時建議低電壓短時間的預電泳,清除凝膠内的雜質,疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通(恒壓10-20V,20-30min)。

5. 加樣前樣品應先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質帶的拖尾現象。

6. 為避免邊緣效應,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。

7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20存放數,,但是反複凍融會使蛋白質降解。

8. 為減少蛋白質條帶的擴散,上樣後應盡快進行電泳,電泳結束後也應直接或者轉印。

9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。

10. 取出凝膠後應注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為标記(如左上角)轉膜時也應用同樣的方法對NC膜做上标記(如左上角)以分清正反面和上下關系。

11. 轉膜時應依次放好NC膜與凝膠所對應的電極,即凝膠對應負極,NC膜對應正極。

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