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作者簡介

盧林芃、吳雪娟、陳樣、魏嘉浩，南京理工大學電子工程與光電技術學院博士研究生在讀；

高妍妍，南京理工大學電子工程與光電技術學院碩士研究生在讀。

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顯微成像應用與挑戰

在我們的世界裡，沒有一種物質的形式會比活細胞更令人驚訝：微小、脆弱、複雜得不可思議。然而細胞非常微小，直到17世紀，列文虎克發明光學顯微鏡，人類才第一次觀測到細胞（如圖1所示）。在過去的幾個世紀中，顯微鏡已逐步演變成一種極為重要且精密的觀察與計量科學儀器，涵蓋了從微小細菌到組織切片的可視化觀察，為人類探索微觀世界做出了重要貢獻。

圖1 列文虎克發明第一台顯微鏡

近年來，随着生活水平的提高，人們對生活質量和身體健康的關注度越來越高。然而，各類疾病年輕化态勢已成為不争的事實。疾病的早期發現、精确診斷是進行有效治療的關鍵。作為生物醫學檢測、分析的核心儀器——光學顯微鏡，在早期篩查、細胞培養、藥物研發等過程中發揮着舉足輕重的作用。

随着生命科學問題的深入研究，檢驗醫學對檢測手段需求的提高，光學顯微成像技術獲得了突飛猛進的發展，産生了一系列新的光學顯微鏡，如相襯顯微鏡[1]、微分幹涉相襯顯微鏡[2]、熒光顯微鏡[3]–[5]、激光共聚焦顯微鏡[6], [7]。這些顯微鏡與傳統的明場顯微鏡對比，可以獲得更高的成像分辨率和成像質量，為疾病診斷尤其是重大惡性疾病的早期診斷提供影像學依據（如圖2所示）。

圖2 光學顯微鏡在生物醫學檢測領域方面的應用

然而，伴随着顯微鏡功能的增加、性能的提升，顯微系統愈加笨重、複雜、難以維護以及日趨昂貴。此外，利用熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡對生物樣本進行觀察時，往往需要先對待觀察樣本進行化學染色或熒光标記，以提高成像襯度[8]。這一過程又對待測樣本的制備流程提出了更高要求。這兩方面限制了将其進一步應用于具有無損化、高分辨、大視場、智能化需求的應用領域，使其通常情況下僅存于基礎設施條件較好、具有專業技術人員的實驗室或醫療機構（如圖3所示）。

圖3 現代精密顯微鏡的局限

但與現實情況相矛盾的是，很多流行性疾病多發于基礎醫療水平低下的地區。這些地區更需要性能優良的顯微鏡來幫助鑒别病原體。因此，在保證光學顯微設備成像質量的前提下，更小的體積、更低的成本、更簡便的操作，将可以急劇地降低醫療研究以及檢測的門檻，為資源條件有限地區的急、重症病人提供更快捷、更低價的即時診斷（Point-of-Care Testing，POCT）與治療。

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應運而生

無透鏡顯微鏡

“計算光學顯微成像”[9]是近十年來興起的一項技術。不同于傳統光學顯微成像“所見即所得”的成像方式[10]，計算光學顯微成像采用“先調制，再拍攝，最後解調”的成像方式。它可與顯微鏡、全息術和光散射技術相結合，實現對形态與動态的納米級分辨率，二維、三維、四維（即時間分辨斷層成像）完全透明結構的非破壞性成像。相比于傳統光學顯微成像，計算光學顯微成像展現了革命性的優勢：成像質量更高，成像系統結構更簡單，突破光學系統與圖像采集設備的物理限制等，使其在信息獲取能力、功能、性能指标等方面獲得顯著提升。

近年來，發光二極管（LED）與圖像傳感器等光電器件、現代數字計算機和智能手機的快速革新為計算光學顯微鏡的快速發展提供了新的機遇與空間。其中，“片上無透鏡顯微成像技術”因其體積小型化、成本低廉化等特點成為極具應用前景的研究領域。無透鏡片上顯微成像技術[11]是一種無需借助任何透鏡，直接将待測物體置于或者将其緊靠傳感器表面進行成像的高通量顯微成像技術。“無透鏡”（lens-free），即不采用傳統光學透鏡對樣品進行成像（如圖4所示）。無透鏡設計可降低系統成本、簡化設備結構，并避免成像視場與成像分辨率之間的矛盾。

圖4 無透鏡顯微鏡的優勢

無透鏡片上顯微成像技術主要分為三類，即接觸式投影成像技術[12]–[18]、基于衍射的無透鏡顯微成像技術[19]–[33]和深度學習技術[34]–[37]（如圖5所示）。投影式成像中，樣品直接放置于傳感器表面，空間相幹性有限的光源直接照射相位物體，樣品的投影直接由圖像傳感器采集。這種方法無需任何重構方法，不僅可以用于靜态物體的成像還可以用于細胞分裂、運動以及其他特性的監測。

圖5 無透鏡顯微鏡分類

然而，此類方法要求距離傳感器非常近（需要去除傳感器保護玻璃），這将導緻傳感器非常容易損壞。後一類無透鏡顯微成像技術本質上是依賴計算來消除或者部分消除樣品和成像面之間的産生的衍射現象。具體地，在重構物體的聚焦圖像時，由于缺少相位信息，所以重構後的聚焦圖像往往存在着共轭像，因此相位恢複是無透鏡全息顯微成像過程中的關鍵因素之一。

由于樣品—傳感器距離較小，成像系統數值孔徑接近于1，導緻成像分辨率受到傳感器像素大小的限制。因此，提升成像分辨率成為無透鏡片上顯微成像技術必須克服的難題[38]。為實現像素超分辨成像，發展了諸如光源/樣品/傳感器橫向位移（光源陣列）等方法以獲得高分辨率全息圖，用于恢複同軸成像中丢失的相位信息（相位恢複）。這通常需要多幅全息圖，例如，多個樣品到傳感器的距離[24], [39]–[43]、照明角度[44],[45]、照明波長[46], [47]（如圖6所示）。每一幅全息圖都可作為光場振幅的物理約束，從而在疊代算法中可以強制使得計算的複振幅場與這些采集值保持一緻。

圖6 無透鏡顯微成像難題及克服方法

上述像素超分辨率技術結合相位恢複算法，可使無透鏡顯微鏡獲得億像素級高通量成像。通常，上述超分辨技術需要借助額外的可控機械裝置或波長校準和色散補償過程來獲取所需的系列低分辨率圖像，再通過特定的計算過程獲得更小的有效像素，從而達到超分辨成像的效果。但機械裝置的引入，将導緻整個系統的複雜性與成本顯著增加，是一個需要協調平衡的重要因素。

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無透鏡全息顯微鏡CyteLive

高通量細胞分析儀

這裡介紹本實驗室設計的無透鏡顯微鏡設備：無透鏡全息顯微鏡CyteLive —— 高通量細胞分析儀。無透鏡全息顯微鏡CyteLive結構簡單，它去除了傳統顯微系統中的物鏡，采用多波長LED陣列照明模式，利用緊貼待測樣品的成像探測器直接記錄近場衍射圖像。無透鏡全息顯微鏡CyteLive基于菲涅爾域中光強傳輸與波長的可置換性，使用多波長照明實現非機械離焦，并利用非幹涉相位恢複技術（光強傳輸方程，TIE）[48]–[51]實現高通量重構樣本信息。

因此，無透鏡全息顯微鏡CyteLive可在29.8474 mm2的寬視場下，實現870 nm的超像素分辨率成像，為生物醫學等領域提供對樣品進行無标記、高通量定量相位成像，有望為遠程醫療應用或醫療點診斷提供具有成本效益的顯微工具（如圖7所示）。

圖7 設計概念、成像功能、性能指标和預期的生物醫學應用

無透鏡全息顯微鏡CyteLive不包含任何可移動結構，主要由彩色LED單元和單色CMOS傳感器組成，如圖8所示。

圖8 系統示意圖

LED照明可産生近似空間相幹照明，其中心波長分别為631 nm（紅色）、522 nm（綠色）和465 nm（藍色）（帶寬 ~10 nm，尺寸 ~100 μm），不僅有效抑制了由寄生反射引起的散斑噪聲與失真，還極大降低了無透鏡顯微鏡的硬件成本。LED放置在距離樣品平面 80 mm處，依次産生紅光、綠光和藍光來照亮樣品。使用像素尺寸為1.67 µm的工業相機（The Imaging Source，DMK-24UJ003，3872×2764）拍攝圖像。空間相幹門控樣品需盡可能靠近傳感器表面放置（< 1 mm），以便于高分辨率相位成像。基于上述配置下，無透鏡全息顯微鏡CyteLive尺寸為130×80×75 mm3。

2） 原理算法

無透鏡全息顯微鏡CyteLive通過波長掃描，來捕獲不同波長（紅、綠、藍）下的三個強度圖像。基于衍射傳播理論，波長和傳播距離總是成對出現，這意味着波長的變化對光場傳播的影響與傳播距離的變化是等效的。因此，在多波長照明下捕獲的圖像可以轉換為多深度圖像，如圖9所示，使用TIE相位恢複算法和GS疊代算法實現像素超分辨的重建[52]。

圖9 無透鏡全息顯微鏡CyteLive技術路線圖

為避免算法在早期疊代後收斂停滞甚至陷入局部最優，可在疊代過程中加入增量梯度法，通過自适應步長法以提高重構過程對噪聲的穩定性及魯棒性[53]。最後，疊代恢複得到的複振幅被傳播回物平面以使圖像重新聚焦，從而産生清晰的聚焦強度與相位，可有效消除離焦模糊。此外，重構相位可用于生成顯示樣本相位梯度信息的數字差分幹涉相襯結果、三維剖線信息及相襯結果，從而實現“數字多模态成像”。

如圖10所示，無透鏡全息顯微鏡CyteLive可獲得具有清晰亞細胞結構的大視場定量相位成像結果，為活細胞高通量原位觀測提供可能。

圖10 HeLa細胞的高通量重建定量相位結果

我們的自主開發系統配套軟件如圖11所示，圖具有實時圖像采集、相位重構、自動聚焦、差分幹涉相襯、三維渲染等多模态顯示功能，并可提供細胞計數、剖面分析等智能化細胞分析工具。可為活細胞研究提供智能化、自動化、易操作的友好交互窗口。

圖11 配套軟件展示

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未來展望

片上無透鏡顯微成像是一個極具發展前景的大視場高分辨率計算成像技術。它把高分辨率顯微成像中對光學系統較高的硬件需求轉化為可通過計算解決的問題。因此，可極大地縮小系統體積、降低系統成本、突破硬件物理限制。

“無透鏡全息顯微鏡CyteLive”（圖12）作為無透鏡顯微技術的初代産業化儀器[54]，為實現面向床旁檢驗應用的高分辨、小型化、低成本、簡單易用的顯微設備提供一份藍本。後續的儀器研制及相關産業化将有助于解決貧困地區疾病早期診斷困難的問題，有望為降低患病死亡率，改善醫療健康提供助力。

圖12 無透鏡全息顯微鏡CyteLive實物展示

參考文獻 略

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