類器官簡介：類器官是一種新興的更加接近體内生理性狀的一種3D細胞培養技術，通常由多能幹細胞PSC或成體幹細胞ASC在合适的培養條件下，培養分化形成的一種類似原對應器官的3D細胞結構，其細胞組成種類和細胞的排列順序與對應的器官相同或者相近。

類器官技術興起之後，迅速應用于癌症與腫瘤的研究，各種腫瘤類器官培養方法不斷的湧現，相對于動物模型，類器官成本低、時間短、生理相關性更高。癌症細胞系大多是2D培養，在成系的過程中已經有了适應馴化甚至發生了基因變異，與細胞系相比腫瘤類器官類器官生理相關性更高，更加接近體内的真實狀況。

目前世界各國紛紛建立PDO（病人來源的腫瘤類器官）樣本庫，用類器官進行免疫治療的研究與驗證，也越來越流行，頻頻見于CNS知名科研雜志的文章。

今天給大家隆重介紹類器官大神Hans Clevers與去年12月18号發表于Nature 期刊的一篇類器官在免疫學研究中的應用綜述。

Clevers是成體上皮類器官的權威學者，因此本文主要對免疫學中如何運用類器官技術研究上皮-免疫細胞的相互作用，以及這種相互作用在組織發育、穩态和疾病如癌症中的角色。

上皮組織是人體與外界的屏障，例如皮膚，胃腸道，肺髒和胸腺。在《腸道衰老與代謝二》中對腸道的屏障作用有所論述。

除了血液和淋巴結，免疫細胞在上皮組織中的含量最高，免疫細胞也直接的和上皮細胞相互作用。這種相互作用對免疫細胞的成熟（胸腺）和激活（如傷口）有一定的作用。

上皮組織是接觸病原體的第一道防線，和免疫系統一起對病原體的感染快速的反應。但是不同組織器官的上皮組織對病原體的反應是不同的，甚至同一個器官，例如腸道，在不同的腸段，上皮的組成和微生物組也不同，對應的組織駐留的免疫細胞也不同。

這種錯綜複雜的上皮-免疫相互作用不但是預防和控制病原感染的前提，同時對阻止過度免疫激活也非常重要。

傳統的研究上皮-免疫相互作用的模型已經建立多年，在feeder飼養層上培養上皮幹細胞已經有50多年的曆史。近期建立的一些上皮類器官，如腸道，皮膚，肝髒等，模拟了體内的環境可以作為體外實驗的模型。具體的類器官培養體系的建立，可以購買stemcell的試劑盒。基本的套路就是在細胞外基質的支撐下，合适的細胞因子，成體上皮幹細胞就會自發的組織形成3D細胞結構。用多能幹細胞也可以分化形成上皮種類的類器官（如腸道，肝髒）。

腸道類器官示意圖

與基于飼養層2D細胞培養對比，類器官技術可以在确定的條件下對幹細胞進行長期的擴增和分化，不受血清批次差異的影響。同時類器官含有原組織中對應的多種細胞類型（如上圖），在長期的傳代中可以保持基因型和表型的穩定。這些特點讓類器官應用廣泛，同時也可以進行多種實驗，例如成像，分子，基因編輯等。

類器官技術也簡化了上皮-免疫細胞之間相互作用的研究，随着癌症類器官模型的建立和其他的免疫學疾病如炎症腸病IBD研究模型的建立，免疫系統在上皮疾病中的病理機理可以被進一步研究。

Stemcell 類器官産品

自從用了stemcell的類器官，節省了大量的摸索自配時間，有了問題還能咨詢廠家技術專家，穩定可靠的産品才能支持穩定可靠的實驗結論，才能發CNS。

類器官技術也可以整合到器官芯片（organoid on chip）平台中，建立更加複雜的培養系統。如果多種類器官集成在一個器官芯片上，完全可以模拟藥物在體内的流轉過程，比如在胃腸道中消化，然後到肝髒中代謝，然後再轉到靶器官，然後在到腎髒排出。這種前景想想就激動。

其他的高級玩法包括：1）翻轉極性，2）融合到管子上，形成更接近體内的管狀結構，3）轉為2D培養。

與動物模型相比，類器官可以更加簡化的直接研究不同細胞的相互作用，另外動物和人類之間有着巨大的區别，因此動物研究轉化到人類醫學應用會面臨複雜的問題，例如有些研究尤其是神經系統無法用動物模型研究轉化。

考慮到這些因素，類器官在免疫學的研究中就非常有用了。雖然如此說，但是這個領域還處于幼兒期。在可以預見的未來，類器官技術還是需要其他的技術方法的補充配合，例如動物模型，才能更加全面的理解複雜的免疫相互作用。

這篇文章讨論了最前沿的在免疫學研究中類器官的應用，重點突出了以下幾個方面：1）組織發育和成體穩态中上皮-免疫相互作用，2）組織再生中的免疫系統的作用，3）炎症疾病和腫瘤微環境。同時也讨論了類器官在免疫治療中的應用和臨床應用中需要克服的挑戰。

後面兩期的内容如下：

類器官與免疫學研究中篇

胚胎發育

由于Mouse在出生之後外周組織中才會出現淋巴細胞，因此研究人類胚胎腸道和免疫細胞的相互作用需要新的技術方法。因此用mouse和human胚胎腸道産生的類器官可用于胚胎發育時期的上皮-免疫細胞相互作用。

例如近期的一個研究鑒定了一群CD4 CD69 的Tem效應記憶細胞，可以産生腫瘤壞死因子TNF并表達基因促進上皮細胞的生長和增殖。這個研究用了人類胚胎腸道類器官，發現低劑量的TNF可以支持腸道幹細胞ISC的增殖，然而高劑量的TNF會誘導腸道幹細胞ISC凋亡并因此會阻斷腸道幹細胞ISC的擴增。

和上面結果一緻的是，類器官和少量的自體胚胎Tem共培養會增強類器官的生長，這種增強效果可以被TNF抑制阻斷。相反，大量的Tem和類器官共培養會抑制類器官的生長，同樣也可以用阻斷TNF逆轉。

這個類器官系統可以作為研究新生兒壞死性小腸結腸炎的模型，因為患兒的Tem數量比正常兒童高很多。

這個研究表明胚胎來源的類器官可以方便的用于研究疾病相關的上皮-免疫相互作用。

成體穩态

如前面所提到的，上皮-免疫相互作用在維持哺乳動物穩态平衡扮演了重要的角色，包括免疫細胞的發育，邊界組織（皮膚和小腸等）的動态平衡。下面就探讨類器官在研究這些動态平衡中的應用。

胸腺類器官研究T細胞發育

胸腺是T細胞發育成熟的地方。T祖細胞從骨髓到胸腺皮質進行陽性篩選，然後在髓質進行陰性篩選。胸腺的這些區域包含了兩種不同的上皮細胞：皮質胸腺上皮細胞cTEC和髓質胸腺上皮細胞mTEC。

重新構建胸腺的3D環境對研究胸腺的功能是非常關鍵的。已經有多個胸腺類器官的方法被報道。大部分是用胚胎或者新生的mouse或者human的胸腺組織建立的胸腺類器官，但是也有報道用人胚胎幹細胞分化為胸腺類器官。這些類似胸腺的結構都可以産生有活性的T細胞并且可以移植到裸鼠中發揮功能。有趣的是，雖然長期的培養是可能的（最長56天），但是連續傳代之後，細胞喪失了克隆形成能力。

因此克服長期培養的挑戰是未來的一個方向。

雖然雙功能TEC前體在成年鼠中被描述（然而有争議），但是目前還不能用單個幹細胞産生同時包含cTEC和mTEC的胸腺類器官。

在很多的疾病中，胸腺都會失去功能，因此研究胸腺上皮和免疫細胞之間的相互作用是有益處的。

上皮細胞作為細菌的免疫哨兵

上皮細胞是身體防禦病原體的的重要組成部分，因此會表達各種識别病原體的受體。如上期所提及，不同的上皮組織有不同的微生物，那麼上皮細胞識别的受體也不同，即使在同一器官也是如此，典型的例子就是腸道。不同的腸道的TLR的表達是不同的，同樣不同位置産生的腸道類器官也忠實的反映了不同的表達模式。此外，下遊用微生物産物刺激不同的TLR發生的轉錄組學的變化也是不同的。

這些數據說明，腸道中基礎的TLR的表達模式不依賴于微生物和免疫細胞。

然而，盡管用TLR配體刺激類器官誘導産生了特異性的抗微生物的基因表達譜，但是抗微生物的多肽卻不是TLR刺激誘導産生的，而是免疫細胞分泌的細胞因子誘導産生的。

盡管潘氏細胞表達TLR5，但是誘導潘氏細胞去顆粒化和extrusion的不是TLR5的配體，反而是IFN-(。

這些觀察強調了上皮，共生微生物和免疫系統之間的相互作用的複雜性。讓複雜性更一步的是，額外的細胞類型，例如上皮下面的基質細胞，腸神經元，都會同時影響上皮細胞和免疫系統。

免疫複合物影響上皮細胞的分化

用上皮類器官和不同的細胞共培養,可以在體外研究上皮細胞和其他細胞之間的複雜相互作用。數個近期的研究表明免疫細胞分泌的細胞因子和微生物會顯著的影響上皮細胞的分化。

最典型的例子就是M細胞。M細胞是一種負責轉運的細胞，位于覆蓋在粘膜相關淋巴組織上的濾泡上皮，例如腸道的Peyer's貼片或者相似的呼吸道組織就是這種類型的濾泡上皮。

通過把腔内的物質運輸到濾泡上皮下面的造血細胞，M細胞在誘導免疫反應中扮演了重要的角色。缺少M細胞mouse 分泌性的IgA下降并且生态失調。在腸道中，M 細胞由Lgr5 陽性的腸道幹細胞分化而來。M細胞的分化需要NK-KB配基RANKL的刺激信号，RANKL由臨近濾泡上皮的基質細胞表達。RANKL刺激之後會表達M細胞的早期标志物SPIB。

如果腸道類器官培養基中沒有RANKL，則腸道類器官中就沒有M細胞，這就說明腸道幹細胞需要外部信号才能分化為M 細胞。

M細胞極為稀有，同樣稀有的還有tuft細胞和腸内分泌細胞，這就說起了腸道類器官的另外一個重要作用，就是可以擴增研究這些極為稀有的細胞。

利用類器官研究這些極為稀有的細胞，有時候會有意想不到的結果。例如基于動物實驗，人們假設IL22信号會導緻M細胞的數量下降，但是在RANKL處理培養的類器官中加入IL22, 并沒有改變M細胞相關基因的表達水平。這說明IL22的信号不是直接作用于M細胞的分化。具體的機理還不清楚，可以繼續研究發文章啊。

免疫細胞分泌的細胞因子也會影響上皮細胞的分化。例如IL13可以在mouse 腸道類器官中誘導杯狀細胞的分化，而上皮細胞分泌的IL33可以增強ILC2的IL13的表達。IL13和IL14可以誘導腸道類器官中tuft細胞的分化。文中還有大段的論述，不在一一的翻譯。這些結果和發現都是用腸道類器官和各種免疫細胞共培養做出來的。所以啊，類器官是免疫細胞的共培養是研究免疫和成體幹細胞分化的利器。

與上皮細胞的相互作用影響免疫細胞的表型

上面說的是免疫細胞及其分泌的細胞因子對上皮細胞分化的影響，那麼這一部分就是反過來論述與上皮細胞的相互作用也會影響免疫細胞的表型。

上面的部分通過簡單的類器官共培養就*能出這麼多的信息量巨大的成果。然後驅動粘膜免疫的上皮-免疫細胞相互作用，不僅僅是通過可溶性因子調節。在多種組織中都有一群駐留在組織中的淋巴細胞被稱為上皮細胞間淋巴 細胞IELs，例如在腸道和其他組織中駐留的T細胞。這些駐留型的CD4/CD8T細胞要麼是在胸腺中發育的，要麼是在感染之後留在組織中的記憶性細胞。

在mouse，隻要靠近上皮細胞就足以改變T細胞的表型。這點也通過類器官共培養實驗驗證，mouse腸道類器官培養基中添加T細胞存活必須的細胞因子就可以擴增和維持IELs。另外，OVA特異的在體外激活的脾髒naïve CD8 T 細胞，在和表達OVA多肽的腸道類器官共培養的時候獲得了IEL的表型，說明了抗原特異的相互作用參與了這個分化的過程。

近期有研究發現mouse一個腸道幹細胞的亞群可以行使非經典的抗原呈遞功能，通過抗原呈遞，這些腸道幹細胞ISC激活了腸道粘膜固有層的CD4T細胞，從而産生了各種各樣的Th細胞分泌的細胞因子，這些細胞因子又反過來影響了腸道上皮的分化。有意思的是腸道類器官和抗原特異性的naïve CD4共培養并沒有激活T細胞，但是經過分選的腸道幹細胞ISC和T細胞共培養卻可以激活T細胞。這種差别也許可以用類器官中腸道幹細胞ISC比例太低解釋。

還有很多未解之謎等着用類器官共培養的方法去發現去探索，後面舉了很多例子，不再一一列舉。

類器官共培養的技術也可以用于研究宿主和病原的相互作用，類器官共培養的研究證明可以用類器官作為研究微生物存活和增殖的的模型。盡管這些研究集中在病原體，類器官技術可以用于評估在共生菌存在的情況下免疫-上皮相互作用對腸道動态平衡的影響。通過微生物condition的培養基配合mouse 腸道類器官，發現微生物代謝物（主要是短鍊脂肪酸，簡稱SCFA）可以極大的影響mouse腸道類器官的基因轉錄。也有很強悍的證據說微生物代謝産物可以影響腸道的免疫系統。通過微生物代謝無得免疫調節功能，這些短鍊脂肪酸SCFA也許可以保護粘膜炎症和阻止腫瘤生成。

然而上皮細胞在免疫細胞對微生物代謝物的反應中的作用還不清楚。微生物代謝物，上皮細胞，免疫系統這三者之間的複雜相互作用，非常值得研究，而且這三者之間的共培養是研究這個問題的重要工具。

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