2020年11月22日，國際著名植物生物學與生物技術期刊Plant Biotechnology Journal 在線發表了王道文團隊題為“Efficient expression and function of a receptor-like kinase in wheat powdery mildew defense require an intron located MYB binding site”的研究論文，伯小遠今天就和大家一起分享這篇文章，跨年的同時順便學習一點知識，是不是更有收獲呢！

受體樣激酶在小麥白粉病防禦中的有效表達和行駛功能需要一個MYB結合位點的内含子

文章掃盲

小麥品種：文中提到的小麥品種有普通六倍體小麥和四倍體小麥，其中水源11、中國春和小偃54屬于六倍體小麥，Stewart屬于硬粒四倍體小麥，文中進行遺傳轉化所用到的品種是Stewart，屬于四倍體小麥；

LRK10L-RLKs：LRK10樣受體激酶；

TaRLK-R1， -R2和-R3：屬于LRK10L-RLKs，對小麥對條鏽菌具有抗性作用；

TtdLRK10L-1：本文研究的主角，正體代表蛋白，斜體代表基因，在硬粒小麥品種Stewart中鑒定出來的，在氨基酸序列和一級結構上與LRK10高度相似；

Bgt: Blumeria graminis f. sp. Tritici 的縮寫，白粉病緻病菌禾苗枯病菌；

MYB-BS：順式元件，MYB轉錄因子結合位點；

CL-1、CL-2、CL-3：TtdLRK10L-1 cDNA轉基因株系；

GL-1、GL-2、GL-3：TtdLRK10L-1 gDNA轉基因株系。

背景介紹

植物已經進化出一種複雜的天然免疫系統來防禦病原體攻擊，根據功能可以劃分為兩種形式：病原體相關分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP）觸發免疫（（PAMP）-triggered immunity，PTI)和效應觸發免疫（Effector-triggered immunity，ETI）。許多植物受體樣激酶（Receptor-like kinases，RLKs）已被證明能夠感知和處理不同病理系統中入侵病原體的信号。它們通常作為PTI中的模式識别受體（Pattern-recognizing receptors，PRRs），并被特定的病原體迅速激活。根據RD結構域的存在或缺失，植物和動物的RLKs可分為RD激酶和非RD激酶。迄今為止，在水稻和拟南芥等基因組較簡單的模式植物中已廣泛研究了幾種RLKs在病原抗性中的作用。相比之下，RLKs在具有複雜基因組的作物抗病性中的作用方面，進展就少了很多。

小麥白粉病嚴重降低了全球小麥作物的産量和質量，培育和利用耐禾苗枯病菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici，Bgt）的小麥品種仍然是防治這種疾病最有效、經濟和環境友好的方法。LRK10-like RLKs （LRK10L-RLKs）最早在小麥及其親緣植物中被報道， LRK10蛋白的主要結構包括一個信号肽、一個富含半胱氨酸的胞外結構域、一個跨膜結構域和一個預測的胞内絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。它們靶向于質膜，屬于非RD激酶。LRK10基因的表達受發育和環境兩方面的調控。LRK10基因的複雜調控與啟動子和内含子區域中存在的大量順式元件的存在有關，但是目前還沒有實驗證據來驗證這些順式元件的功能。另外，三種LRK10L-RLKs (TaRLK-R1， -R2和-R3)已被證明對小麥條鏽菌（Puccinia striiformis f. sp. Tritici）的超敏感抗性具有積極作用。然而，LRK10L-RLKs是否參與小麥對Bgt感染的防禦應答尚不清楚。

綜上所述，本研究的主要目的是研究LRK10L-RLKs是否在小麥對Bgt的防禦中發揮作用，以及内含子順式元件是否會影響LRK10L-RLKs的表達和功能。

為了達到以上目的，作者做了如下實驗：

TtdLRK10L-1的結構和表達特征

1.1 轉基因受體材料選擇

作者曾對六倍體普通小麥中的3種LRK10L-RLKs (TaLRK-R1、-R2和-R3)進行了初步的功能分析，由于普通小麥品種（水源11、中國春和小偃54）基因轉化困難，為了深化研究，本文作者分析的是适合農杆菌介導的遺傳轉化的春硬粒小麥品種Stewart的LRK10L-RLKs。

1.2 研究基因的确定

又因為TRITD1Av1G004220在氨基酸序列和一級結構中與LRK10和TaRLK-R1、-R2和-R3高度相似，因此本文将重點放在編碼TtdLRK10L-1的TRITD1Av1G004220上，後續的實驗都以此基因展開。

1.3 基因結構分析

對于TtdLRK10L-1的結構分析如下：TtdLRK10L-1蛋白包含一個信号肽、一個富含半胱氨酸的胞外結構域、一個跨膜結構域和一個包含植物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶共有的12個亞結構域的胞内激酶結構域（圖1）。TtdLRK10L-1的基因組序列有2個内含子和3個外顯子，第一個内含子（intron I, 1015 bp）的大小明顯大于第二個内含子（intron II, 191 bp）（圖2a）。

1.4 核心元件分析與功能預測

在NEW PLACE數據庫中分析，在TtdLRK10L-1的兩個内含子中發現了多個預測的順式元件。這些順式元件可能參與轉錄因子結合、非生物脅迫反應、組織特異性表達和植物激素誘導。值得注意的是，一個包含一個MYB轉錄因子識别序列（TAACTG）和兩個W-box轉錄因子結合元件的MYB-BS僅存在于intron I中。

圖1. 預測的TtdLRK10L-1氨基酸序列與普通小麥代表性同系物的比較。

兩種類型轉基因株系的構建和表征

2.1 轉基因材料的構建

利用TtdLRK10L-1本地啟動子制備了兩種轉基因Stewart小麥品系。3個獨立的純合子cDNA株系（CL-1、CL-2、CL-3）表達了來自無内含子I、II的cDNA編碼序列的TtdLRK10L-1-GFP轉基因；另外3獨立的個純合子gDNA株系（GL-1、GL-2和GL-3）表達相同的轉基因，但其基因組序列中均含有兩個内含子（圖2b）。

2.2 轉基因材料基因表達鑒定

通過實時TaqMan PCR檢測、基因組PCR、RT-PCR和蛋白印迹分析顯示，在cDNA和gDNA轉基因株系中均存在TtdLRK10L-1-GFP，且轉錄翻譯活躍(圖2c)。值得注意的是，TtdLRK10L-1:GFP在GL-1、GL-2和GL-3中的蛋白水平高于CL-1、CL-2和CL-3（圖2c）。

2.3 轉基因材料基因亞細胞定位分析

共聚焦顯微鏡顯示TtdLRK10L-1:GFP均靶向cDNA和gDNA轉基因株系葉片表皮細胞的質膜（圖2d）。與這一發現相一緻的是，小麥葉肉原生質體中表達的TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白位于質膜中。

圖2. TtdLRK10L-1基因組序列及兩種轉基因植株的鑒定

(a) TtdLRK10L-1相對于LRK10、TaRLK-R1、-R2和R3的外顯子和内含子結構。(b)轉化過程中T-DNA區域的構建示意圖pNP:TtdLRK10L-1 cDNA -GFP（上）或pNP:TtdLRK10L-1 gDNA -GFP（下）。（c）轉基因苗在基因水平、轉錄水平和蛋白水平上的檢測。 (d) TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白在cDNA和gDNA轉基因株系葉細胞質膜上的靶向作用。

gDNA轉基因株系具有更高的基因表達和更強的Bgt防禦

3.1 TtdLRK10L-1 基因受接種Bgt 表達上調（分子原因）

在cDNA和gDNA轉基因株系的苗期接種Bgt，通過RT-PCR和Western blot在轉錄水平（圖3a）和蛋白水平（圖3b）的定量檢測，顯示内源性TtdLRK10L-1在Bgt 感染後逐漸升高。并且三個gDNA系（GL-1、GL-2和GL-3）上調幅度更大。

3.2 菌落數量（直觀結果）

Bgt接種72 hpi後，cDNA和gDNA轉基因株系的Bgt微菌落數量均低于對照組（野生型Stewart和TNS） （圖3c）。與野生型 Stewart和TNS相比，6個轉基因株系接種後第7天葉片上的Bgt菌落也有所減少（圖3d和e）。重要的是，GL-1、GL-2和GL-3的Bgt生長始終顯著低于CL-1、CL-2和CL-3（圖3c、d和e），說明3個gDNA轉基因株系比3個cDNA株系發生了更強的Bgt 防禦。

Bgt 部分穿透（a型）或Bgt感染整個細胞（b型）的氧化爆發構成了宿主細胞白粉病感染強防禦的重要早期過程。用3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）對H2O2的積累進行組織學染色，可以有效檢測到這兩種類型的氧化爆發（圖4a）。

在24 hpi時，野生型Stewart和TNS對照植株中出現這兩種氧化爆發的細胞比例最低，cDNA轉基因株系居中，gDNA轉基因株系最高；另一方面，野生型Stewart和TNS對照植株中未氧化爆發的細胞（c型）的百分比最高，cDNA轉基因株系居中，gDNA轉基因株系中最低（圖4b）。

圖3. TtdLRK10L-1 cDNA （CL-1， -2，和-3）和gDNA （GL-1， -2，和-3）轉基因株系對白粉病（Bgt）感染反應的比較分析

（a）qRT-PCR檢測TtdLRK10L-1-GFP基因在Bgt接種前(0 h)和Bgt接種後兩個時間點（24 h和48 h） cDNA和gDNA轉基因株系中的表達水平。(b)用GFP特異性抗體免疫印迹法檢測6個轉基因株系TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白。（c）測定6個轉基因株系和兩個對照材料野生型 Stewart和轉基因無效分離苗（TNS）接種後72 h Bgt萌發孢子總數中形成的微菌落百分比。（d）接種7天後，Bgt菌落在6個轉基因株系和2個對照（野生型 Stewart和TNS）的葉片表面發育情況。(e)對（d）中不同葉片樣品，使用ImageJ對Bgt菌落的葉面積百分比進行量化。

圖4. Bgt誘導的cDNA （CL-1， -2, and -3）和gDNA （GL-1， -2, and -3）轉基因株系及兩個對照材料野生型 Stewart和轉基因無效分離苗（TNS）在病原菌接種48 h後的氧化爆發分析。

(a) 3,3 -二氨基聯苯胺染色顯示的三種類型的細胞氧化爆裂。a型，Bgt部分穿透氧化爆發；b型，氧化爆發分布在整個細胞；c型，沒有檢測到氧化爆發。(b)定量比較轉基因和陰性對照中a、b、c型細胞氧化爆發的比例。

intro I對TtdLRK10L-1介導的Bgt 防禦的影響

4.1 根據上面的結果進行猜想

前面的結果顯示，3個gDNA株系的TtdLRK10L-1- GFP 轉基因表達量高于3個cDNA株系，Bgt 防禦能力強于3個cDNA株系，提示内含子可能參與了TtdLRK10L-1 的表達和功能調控。

4.2 對猜想進行驗證

為了檢驗這種可能性，将TtdLRK10L-1的cDNA編碼序列和基因組ORF，以及隻有intron I、intron II、具有突變MYB結合位點的intron I（intronI/mMYB-BS）或具有兩個W-box元件突變的intron I（intron I/mW-box）（圖5a），構建到pHZ206載體上，在一周齡Stewart幼苗的葉片中進行單細胞Bgt防禦試驗。

4.3 結果

瞬時轉化細胞中的Bgt Haustorium指數（HI）是防禦Bgt感染的有效指标。如圖5b所示，pHZ206（VC）和pUbi：TtdLRK10L-1intron II的HI值最高，而pUbi：TtdLRK10L-1gDNA、pUbi：TtdLRK10L-1intron I和pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mW-box的HI值最低，pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mW-box的HI值為中間值。

4.4 結論

這些數據表明，缺乏intron I（如pUbi：TtdLRK10L-1intron II）可大幅度降低TtdLRK10L-1介導的Bgt防禦，去除intron II（pUbi：TtdLRK10L-1intron I）或突變intron I中的W-box （pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mW-box）對TtdLRK10L-1在Bgt 防禦中的功能沒有顯著影響，而突變intron I中的MYB-BS（pUbi：TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS）進一步削弱了TtdLK10L-1 對Bgt 防禦的促進作用。

圖5. 用單細胞Bgt防禦實驗分析内含子參與TtdLRK10L-1的表達和功能。

(a)實驗中TtdLRK10L-1的WT和突變ORFs的結構圖。 (b)在單細胞Bgt防禦試驗中表達WT和TtdLRK10L-1突變ORFs所賦予的Haustorium指數值。

TtdLRK10L-1 intron I中的MYB-BS增強了

超級啟動子活性

5.1 實驗方法

利用T-DNA載體SP1300:LUC，該載體攜帶一個超級啟動子驅動的LUC報告基因，利用該載體構建所需要的載體。構建到載體中的結構包含TtdLRK10L-1gDNA、TtdLRK10L-1cDNA、TtdLRK10L-1intron I、TtdLRK10L-1intron II、TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS或TtdLRK10L-1intron I/mW-box上，并且它們都位于LUC的上遊。載體構建好之後進行注射煙草實驗。

5.2 結果

在第一組中，比較了SP：TtdLRK10L-1cDNA-LUC、SP：TtdLRK10L-1gDNA-LUC、SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC或SP：TtdLRK10L-1intron II-LUC的LUC信号（圖6a和d），表明intron I的存在（如SP：TtdLRK10L-1gDNA-LUC和SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC）是必要的，具有更高水平的LUC信号。

在第二組中，比較了SP：Ttd LRK10L-1cDNA-LUC、SP：Ttd LRK10L-1gDNA-LUC、SP：Ttd LRK10L-1intron I/mMYB-BS-LUC或SP：Ttd LRK10L-1intron I/mW-box-LUC産生的LUC信号（圖6b和e），表明SP：Ttd LRK10L-1gDNA-LUC産生的較高LUC信号需要MYB-BS的存在，而不是W-box元件。

在第三組中，對來自SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC、SP：TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS-LUC或SP：TtdLRK10L-1intron I/mW-box-LUC的LUC信号進行了評估（圖6c和f）。這個組合的結果，以及在第二個組合中獲得的結果（圖6b和e），證實了MYB-BS，而不是W-box元件，在SP：TtdLRK10L-1gDNA-LUC或SP：TtdLRK10L-1intron I-LUC産生更高的LUC信号方面的重要性。

5.3 結論

TtdLRK10L-1 intron I中的MYB-BS增強了超級啟動子活性。

圖6. 在本氏煙葉片中利用LUC報告基因分析TtdLRK10L-1内含子I中假定的MYB結合位點(MYB- bs)對超啟動子活性的影響。

(a-c)超級啟動子（SP）驅動WT或TtdLRK10L-1突變ORFs産生的LUC信号。(d-f)分别對(a)、(b)和(c)中所示的測定産生的LUC信号進行定量分析。

本篇文章到這裡就結束了，是不是非常簡單，整體的思路就是找到一個基因——分析結構、預測功能——轉基因驗證，如此簡單的套路我不信你不會，今天分享的這篇文獻主要目的是想讓大家了解内含子的功能，因為很多時候它總是被我們忽略，這隻是冰山一角，更多的還需要大家去發現哦！

下面列舉了幾個關于内含子的研究，有興趣的同學可以去看看喲！

對于真核生物來說，從DNA新轉錄的前體mRNA含有内含子和外顯子序列，通過RNA剪接的過程切除内含子，剩餘的外顯子序列連接在一起以形成成熟mRNA，然後将其翻譯成蛋白質。這也是真核生物編碼基因和原核生物編碼基因最大的區别。

之前的研究通常認為内含子是外顯子連接的可有可無的副産物，因為它們在剪接後迅速降解。

但是切除内含子、連接外顯子，這一過程非常複雜精确。而且更高等的生命内含子更多，如果内含子僅僅作為可有可無的副産物，顯然不符合進化的規律。

2019年1月16日，Nature雜志同期在線發表了兩篇關于内含子的研究論文。這兩項研究都很好地證明了内含子在營養不良條件下的重要性。内含子對于細胞在營養匮乏的培養穩定期的生存是必要的，而且與内含子所在的基因編碼的蛋白質無關。

2020年11月22日，Plant Communications雜志在線發表了關于含有内含子的Cas9能提升基因編輯效率的論文。該論文發現對編輯效率最重要的影響是通過在Cas9編碼序列中增加13個内含子，這可以極大地提高編輯效率。用不含内含子的Cas9獲得的初代轉化體都沒有表現出敲除突變體表型，而用含有内含子的Cas9産生的初代轉化體中，70%-100%顯示了突變表型。這種包含内含子的Cas9基因在煙草和長春花屬等其他植物中也被證明是高效的。

Happy ending

曾經2020還是小學作文裡遙遠的未來，如今也隻剩最後一天了，這一年我們終究還是挺過來了，感謝挺身而出的英雄、感謝默默無聞的守護，所有的不容易都将成為過去！2021年未來可期，伯小遠陪你一起跨年啦！以後你不想看的文獻伯小遠幫你看，不想做的實驗伯小遠幫你做！最後祝大家：新的一年心想事成、大吉大利、牛轉乾坤！

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