冷凍電鏡全稱冷凍電子顯微鏡（Cryoelectron Microscopy），簡單理解為用電子顯微鏡去觀察冷凍固定的樣本，得出清晰三維結構。可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。

左邊是2013年前人們能得到的分子圖像，右邊是冷凍電鏡技術的結果

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　　1. 什麼是冷凍電子顯微鏡技術

　　冷凍電子顯微鏡技術，也叫冷凍電鏡技術，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，即把樣品凍起來并保持低溫放進顯微鏡裡面，用高度相幹的電子作為光源從上面照下來，透過樣品和附近的冰層，受到散射。我們再利用探測器和透鏡系統把散射信号成像記錄下來，最後進行信号處理，得到樣品的結構。冷凍電鏡技術作為一種重要的結構生物學研究方法，它與X射線晶體學、核磁共振一起構成了高分辨率結構生物學研究的基礎。這項技術獲得了2017年的諾貝爾化學獎。獲獎理由是“開發出冷凍電子顯微鏡技術(也稱為低溫電子顯微鏡技術)用于确定溶液中的生物分子的高分辨率結構”，簡化了生物細胞的成像過程，提高了成像質量。

　　2. 冷凍電子顯微鏡成像原理

　　在光學顯微鏡下，可見光穿過标本就會通過光學透鏡進行折射形成圖像。電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是電子顯微鏡采用電子束作光源，采用80-300kV電子束加速電壓，用電磁場作透鏡。兩者的主要區别是分辨率不同，而影響分辨率的直接因素是光源的波長，即波長越短，分辨率越高。光子的波長大概在500nm左右。電子的波長是光子波長的十萬分之一左右。1975年，Henderson通過電子顯微鏡首次解析得到了分辨率為0.7nm的細菌視紫紅質的結構，這些開拓性的研究最終确定了細菌視紫紅質以及其他膜蛋白，如水通道蛋白的近原子分辨率圖。這些研究為許多二十面體病毒的原子分辨率模型的生成奠定了基礎。非有機樣品的分辨率甚至更高，它們在成像過程中承受的電子劑量比生物材料高得多，而且結構完整。

　　那麼，為什麼不能在原子分辨率的電子顯微鏡下，直接對單個蛋白質、病毒和細胞的自然狀态進行常規成像呢?

　　在傳統的透射電鏡下，一般采用使用負染色法來減輕損傷，即在可接觸的分子表面塗上含有重原子的試劑，如醋酸鈾酰，這種試劑的輻射敏感性比有機物低得多。通常形成的細胞、病毒和蛋白質圖像分辨率在2-4 nm。對未染色标本進行高分辨率成像的困難在于，為了使損傷最小化所降低的電子劑量，會産生噪聲圖像，而電子劑量高到足以獲得良好的信噪比時，則會導緻标本損傷達到不可接受的程度。

　　為了解決上述為題，冷凍電鏡技術采用了以下兩種方法，第一種方法是使用保存在液氮或液氦溫度下的冷凍标本進行成像。近40年來，對室溫下衍射強度與低溫下衍射強度衰減的測量表明，低溫電子顯微鏡可以降低輻射損傷的影響。采用一種在一層玻璃态冰中快速冷凍(玻璃化)生物标本，然後在液氮或氦氣溫度下成像的方法，使得低溫電鏡技術得到廣泛應用。将水溶液注入液氮冷卻的乙烷等冷凍液中，是一種用于制備用于層析成像、單顆粒成像以及螺旋和二維晶體的冷凍電子顯微鏡樣品的方法。與室溫下相比，在液氮溫度下成像可以減少多達六倍的輻射損傷。這意味着每單位電子劑量的輻射損傷減少，對于低溫下記錄的圖像，可以使用更高的電子劑量來增加信噪比。事實上，液氮和液氦都被成功地用于近原子分辨率的三維重建，在它們的冷卻下，分辨率可達大約0.4到2 nm。第二種提高信噪比的方法是對大量同一生物标本單元的圖像進行平均。該技術首次應用于螺旋組裝體和二維蛋白晶體的室溫成像及低溫成像。這兩個概念，即低溫成像的概念和多幅低劑量圖像平均的概念，構成了現代高分辨率生物電子顯微鏡的基礎。

　　3. 冷凍電子斷層掃描技術

　　電子斷層成像通過獲取同一區域多個角度的投影圖來反向重構所研究對象的三維結構，适合于在納米級尺度上研究不具有結構均一性的蛋白、病毒、細胞器以及它們之間組成的複合體的三維結構。雖然目前電子斷層成像所獲得的結構的分辨率(約4～10 nm)，但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結構和功能中有着不可替代的重要作用。冷凍電子斷層成像的适用尺度非常廣泛， 包括從分子水平的蛋白質， 到亞細胞水平的細胞器， 以至細胞水平的組織結構。它有效地填補了X- 射線晶體學、核磁共振以及冷凍電鏡單顆粒分析等方法得到的高精度結構和光學顯微鏡技術得到的低分辨率的細胞整體圖像之間的空白。

　　4. 冷凍電鏡單顆粒技術

　　冷凍電鏡單顆粒技術利用大量二維投影圖像的數據，結合蛋白複合物在不同方向上的相同副本，對結構進行三維重建。和大多數其他低溫電子顯微鏡應用一樣，單粒子成像的第一步是将可溶複合物擴散到碳膜的孔上。然後标本被柱塞冷凍，形成一層薄薄的玻璃态冰，理想情況下，這層冰中含有不同方向的複合物的相同副本。冰層的厚度可能從幾百埃到幾千埃不等，受粒子的尺寸和緩沖區的組成的影響。從含有許多分子複合物的場的圖像開始，通過人工或自動算法選擇單個粒子。一旦選擇統計方法，如主成分分析、多變量分析或協方差分析，可用于根據圖像結構特征的變化對其進行排序。從分子複合體的二維電子顯微鏡投影視圖生成三維重建依賴于所有粒子的相對方向。所涉及的步驟在數學上是複雜的，并利用了中心投影定理，該定理指出，對于一個三維對象，每個二維投影的傅裡葉變換是通過該對象的三維傅裡葉變換得到的一個中心切片(圖5)。因此,通過獲得數量足夠大包含相對于電子束各種各樣的方向的分子圖像,可以建立3D圖像(如圖6所示,顯示2D圖像不同取向的GroEL用于獲得其三維結構)。

　　5. 冷凍電子顯微鏡技術的突破

　　在最近幾年，冷凍電鏡技術的突破主要體現在三個方面。首先是樣品制備，通過利用薄膜碳層甚至石墨烯可以用更薄的冰層包裹分子樣品來提高信噪比。第二個突破是電子的探測技術，也就是電子探測器的發明。在300 keV 電子的轟擊下，傳統的器件都會被高能量打壞，因此在電子探測器出現之前，冷凍電鏡中使用的CCD相機需要将電子打在探測器上變成光信号，再通過CCD 把光信号轉成電信号後得到圖像，“電光—光電”轉換的過程降低了信噪比。而現在電子探測器能夠直接探測電子數量，同時，互補型金屬氧化物半導體(CMOS)感光元件的應用使得探測器支持電影模式(movie mode)，可以在一秒鐘之内獲得幾十張投影圖片。通過後期對樣品進行漂移修正，再把這幾十張圖片疊加起來，從而大幅提高成像的信噪比。模糊的圖像一下子變得清晰，冷凍電鏡的分辨率不斷上升。第三個突破是計算能力的提高和軟件算法的進步。冷凍電鏡的模型重構通常需要對幾萬甚至幾十萬張投影圖片進行分析、組裝和優化。這需要先進的計算資源配合有效的算法才能實現。綜上所述，冷凍電鏡技術不僅提高了空間分辨率，而且可以應用于很多以前不能解決的生物大分子的結構研究。[2]

　　參考文獻：

　　[1] Jacqueline L. S. Milne, Mario J. Borgnia, Alberto Bartesaghi, et al. Cryo-electron microscopy – a primer for the non-microscopist.doi:10.1111/febs.12078

　　[2] 冷凍電鏡單顆粒技術的發展、現狀與未來。(來源：中國物理學會期刊網)

　　[3] Hong-Wei Wang,Jianlin Lei, and Yigong Shi.

　　Biological cryo-electron microscopy in China.DOI: 10.1002/pro.3018

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