實時熒光定量pcr反應的基本步驟-tft每日頭條

實時熒光定量pcr反應的基本步驟

生活更新时间:2025-01-16 01:10:39

熒光定量PCR原理

熒光定量PCR技術，是指在普通PCR技術的基礎上，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信号積累監測整個PCR進程，最後通過标準曲線對未知模闆進行定量分析的方法。主要有兩種方法：

1、染料法：SYBR Green 染料

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鍊後，發射熒光信号，而不摻入鍊中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信号，從而保證熒光信号的增加與PCR産物的增加完全同步。

實時熒光定量pcr反應的基本步驟（快速認識熒光定量PCR原理）1

2、TaqMan探針法：

探針完整時，報告基團發射的熒光信号被淬滅基團吸收;PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信号，即每擴增一條DNA鍊，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信号的累積與PCR産物的形成完全同步。

實時熒光定量pcr反應的基本步驟（快速認識熒光定量PCR原理）2

Ct值

1、Ct值含義

Ct值(Cycle threshold，循環阈值)的含義為:每個反應管内的熒光信号到達設定阈值時所經曆的循環數。

2、Ct值與初始模闆的關系

固定循環數後，熒光型号與模闆數成正比；
初始DNA量越多，熒光達到阈值時所需要的循環數（Ct值）越少；
初始模闆的對數濃度與Ct值呈線性關系，根據樣品的Ct值就可計算出樣品中所含的模闆量。

優勢與應用

可完成快速多重檢測；
操作時間短，大通量；
定量：确定發病标準；
數據化，可對比分析；
鑒别診斷，區分野毒；
疫苗質量含量的評價；
動保産品的臨床評估。

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