1、DNA純度在DNA樣品中若含有蛋白質,或沒有去除幹淨制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子,均會降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用;
2、 酶切消化反應的溫度DNA消化反應的溫度,是影響限制内切酶活性的一個重要因素。不同的核酸内切限制酶,具有各自的最适反應溫度。多數限制内切酶的最适反應溫度是37攝氏度,少數限制性内切酶的最适反應溫度高于或低于37攝氏度;
3、DNA的分子結構DNA分子構型對核酸内切限制酶的活性有很大影響,如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍。有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點,其效率也有明顯差異。限制性内切酶反應的終止,通常是采用65攝氏度條件下溫浴5分鐘。
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