目的基因在細胞水平上的導入方式可以通過瞬轉的方式進行，但想要長期在目的細胞中研究基因功能，需要建立穩轉細胞系，可以降低頻繁轉染或者病毒包裝的成本，方便實驗研究。接下來，小編将對整個篩選流程進行一個簡單的介紹。

一、慢病毒介導的穩轉株篩選原理

篩選流程示意圖

實驗原理：通過将外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體轉染至宿主細胞并整合到其染色體中，并随細胞分裂穩定傳遞，最後用載體中所含抗性基因進行篩選。

抗性選擇：常用的真核表達載體抗性篩選标志物有嘌呤黴素(puromycin)、新黴素(neomycin)和殺稻瘟菌素（blasticidin)。

二、準備及預實驗-MOI摸索及

抗性濃度摸索

慢病毒感染MOI預實驗

根據《慢病毒感染手冊》篩選出該細胞的MOI值。

Puromycin工作濃度篩選預實驗

大部分細胞puromycin的工作濃度為1~10μg/ml在《慢病毒感染手冊》上查閱Puromycin目的細胞中篩選的緻死篩選參考用量。部分細胞的參考用量可參見附錄2《常見細胞MOI及感染條件》，請在篩選時設置未感染病毒的野生型細胞對照，加入等量濃度的Puromycin。

如未在附件中找到使用的細胞，在正式實驗前，先進行puromycin梯度篩選預實驗（确定能在2天殺死野生型細胞的最低Puromycin濃度）。具體步驟如下：

1. 提前24h将細胞鋪入24孔闆，細胞量根據細胞生長狀态及大小調節，在24h後，細胞密度在70%左右；

2.細胞生長24h後，加入不同終濃度的puromycin，如圖所示；

Puromycin濃度分組情況

3. 再培養48h，顯微鏡下觀察，将全部殺死細胞的最低濃度的puro組作為工作濃度。

三、穩定株篩選

慢病毒感染48-72h後（70-80%融合度），将細胞繼續培養于含适當濃度Puromycin的培養液中，篩選48h後，空細胞加puro組全部死亡，我們認為感染病毒組剩下全部是陽性細胞，進行以下操作：

A. 混合克隆穩轉株的構建

1. 目的細胞病毒感染

處于對數生長期的細胞胰酶消化，完全培養基制成 3-5×104個/mL細胞懸液，并根據表1接種相應的細胞數到培養闆中，繼續培養保證感染時鋪闆量達到15-30%左右，按照預實驗結果，參考表1更換感染培養基，加入最适病毒量進行感染。參照預實驗結果，選擇感染後最适時間點更換為常規培養基繼續培養，一般為感染後8-16h左右。

表1.貼壁細胞接種和病毒感染時的體積

按照預實驗确定的感染條件，使用感染液将細胞制成 3-5×105個/mL懸液，并根據表2接種相應的細胞數到培養闆中。鋪闆後無需培養，參照預實驗确定的 MOI 加入最适病毒量感染。參照預實驗結果，選擇感染後最适時間點，一般為 8-16h 左右，将各孔中細胞收集到幹淨的 1.5 ml EP 管中，以 1300 rpm 離心 2 min，去掉上清液，更換為完全培養基，輕輕混勻後放回培養闆中繼續培養。

表2.懸浮細胞接種體積

2. 感染後細胞加入抗生素篩選

1）感染 72h 後，觀察細胞狀态和感染效率。要求細胞狀态良好，未出現大量死亡現象，特别是保證 NC 組與 CON 組細胞狀态相當。

2）加入合适濃度的抗生素，篩選至少 48h。如病毒載體帶有熒光标記，熒光效率需要達到 100%後，降低抗生素維持濃度（相較之前的藥篩濃度，濃度減至之前濃度的 1/2~1/4 或更低）繼續對感染後的細胞進行篩選和擴增，同時收集細胞進行下遊 qPCR 檢測（鑒定目的基因表達水平）。

3. 細胞擴增、凍存、複檢

1）将加入抗生素維持濃度的細胞繼續進行擴增。待 qPCR 檢測結果合格後進行凍存，保證每株細胞至少凍存 6 支。

2）凍存2-3天後，任意複蘇一支，判斷複蘇細胞狀态。

B. 單克隆穩轉株的構建

對感染并篩選後的混合克隆穩轉株細胞進行稀釋培養，挑取單一細胞生長而成的細胞克隆，再進行擴大培養，以獲得性狀單一、表達穩定的細胞株：

具體步驟如下：

1）将細胞消化後接種于96孔闆中，接種的細胞密度為1個/孔（可通過有限稀釋的方法，也可通過流式分選）；

2）标記出具有單個細胞的孔等細胞擴增後用puro進行篩選；

3）篩選完畢後，收集細胞進行qPCR或Western Blot鑒定，選擇鑒定結果正常的單克隆細胞凍存保種

另外小編也整理了一些稀釋法的方案給大家作為參考：

1）倍比稀釋篩選

細胞計數設定首排的濃度，例如首孔設置10* cells/孔，每孔50*μl （細胞濃度：100* cells/ml），96孔闆補足最終培養體積100ul。

倍比稀釋方法舉例

注：标*體積均為參考，大家可以根據自己的實際情況進行調整

2）兩步系列稀釋篩選

兩步系列稀釋方法舉例

稀釋倍數參考：以首孔濃度選擇1E4cell/孔*舉例，标紅區域出現1個細胞的概率更大

3）直接稀釋至1個/孔：以96孔闆為例，将細胞消化後接種于96孔闆中，接種的細胞密度為1個/孔。

前面介紹的都是關于單個病毒的穩轉株構建方法，如果是兩個病毒的話，具體應該如何操作呢？下面，小編以吉凱基因CRISPR/Cas9雙載體慢病毒為例進行介紹。

首先，讓我們了解一下載體系統：

吉凱CRISPR/Cas9雙載體慢病毒質粒系統

1. 雙載系統：通過兩個慢病毒分别向細胞導入 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列表達框，從而實現對目的基因的敲除。Cas9 蛋白載體帶有嘌呤黴素标記，sgRNA 帶有綠色熒光标記/紅色熒光/新黴素抗性可選。

2. 具體實驗步驟：

1）Cas9慢病毒穩轉株構建

先感染Cas9慢病毒，參照《慢病毒感染手冊》，選擇MOI在70-80%的病毒劑量進行Cas9慢病毒穩轉株的構建，經合适濃度的Puromycin抗藥性篩選，得到穩定表達Cas9的混合克隆細胞株（待熒光為100%後将puromycin濃度減至之前濃度的 1/2~1/4 或更低維持）；

2）Cas9慢病毒穩轉株的凍存

可以先将構建好的Cas9穩轉株凍存作為工具細胞株，後續其他實驗也可用該細胞株進行；

3）sgRNA慢病毒感染

a. MOI摸索預實驗：可參考Cas9慢病毒MOI進行，也可以用sgRNA對照慢病毒進行預實驗，摸索合适的MOI，選擇MOI在70-80%的病毒劑量進行sgRNA慢病毒感染實驗；

b. 篩選靶點有效性：分别使用sgRNA慢病毒對Cas9穩轉株進行感染，判斷靶點有效性，選取有效的sgRNA慢病毒進行後續穩轉株的構建。

c. 有效Cas9-sgRNA穩轉株的構建：篩選出有效靶點後，可進行多克隆、單克隆穩轉株的構建（如需構建單克隆穩轉株，建議篩選出有效靶點後再進行單克隆穩轉株篩選，否則會導緻工作量較大）。

d. 報告基因的選擇及後續維持：一般第二次感染病毒的報告基因默認選擇新黴素抗性，除此之外也可選擇熒光标簽進行篩選，需要注意的一點是，報告基因的選擇的選擇決定了後續穩轉株的篩選方式（真核抗性篩選or流式分選）

• 如使用新黴素抗性，後續即為嘌呤黴素 新黴素抗性篩選（篩選成功後，需同時加入這兩種抗性，濃度為篩選時的 1/2~1/4 或更低維持）；
• 如使用熒光蛋白标簽篩選，則第二次感染之後需要使用流式分選熒光蛋白表達陽性的細胞，穩轉株構建成功後需要嘌呤黴素抗性（濃度為篩選時的 1/2~1/4 或更低維持）。

與單載體系統相比，雙載體系統需要兩個病毒進行感染，同時可以得到Cas9慢病毒穩轉株作為工具細胞株，大家可以根據自己的實驗需求進行選擇，把控好病毒的感染時間、調整好細胞狀态，同時也要提前考慮好選擇兩種不同的抗性篩選方式，從而完成穩轉株的篩選。

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