細胞直接計數法的幾種具體方法?實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目，現在小編就來說說關于細胞直接計數法的幾種具體方法?下面内容希望能幫助到你，我們來一起看看吧!

細胞直接計數法的幾種具體方法

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

具體操作：

1. 将計數闆及蓋片擦拭幹淨，并将蓋片蓋在計數闆。

2. 将細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數闆之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

3. 計算闆四大格細胞總數，壓線細胞隻計左側和上方的。然後按公式計算：

細胞數/mL=四大格細胞總數/4×10個/ml

(注：當細胞很多時，可在四個格中選一定數目較平均的小格，由于每大格中有16個小格，然後計左側和上方的細胞數，求出每小格的細胞數，取平均值m，m×16即每個格的平均值。所以，細胞密度=m×16×10個/ml)

說明：公式中除以4，因為計數了4個大格的細胞數。

公式中乘以10因為計數闆中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm

而 1ml=1000ul=1000mm

（注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。）

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細胞計數闆的使用

一、血球計數闆-基本構造

血球計數闆是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有四個槽構成三個平台。中間的平台較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各刻有一小方格網，每個方格網共分九個大格，中央的一大格作為計數用，稱為計數區。計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。

計數區邊長為1mm，則計數區的面積為1mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片後，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。

使用細胞計數闆計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。

二、細胞計數闆-使用方法

1．視待測菌懸液濃度，加無菌水适當稀釋（斜面一般稀釋100倍），以每小格的菌數可數為度。

2．取潔淨的細胞計數闆一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。

3．将菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數闆中間平台兩側的溝槽内沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡産生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多餘菌懸液。也可以将菌懸液直接滴加在計數區上（不要使計數區兩邊平台沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片後，造成計數區深度的升高），然後加蓋蓋玻片（勿使産生氣泡）。

4．靜置片刻，使細胞沉降到計數闆上，不再随液體漂移。将細胞計數闆放置于顯微鏡的載物台上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區後，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。

5．計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央1個大方格的菌數（即80個小格）。為了保證計數的準确性，避免重複計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計應有統一的規定。如菌體位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規定計入相應的格中。見下圖：即本格中計數細胞為3個。

6．對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重複計數2-3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），按公式計算出每mL（g）菌懸液所含細胞數量。

7．測數完畢，取下蓋玻片，用水将細胞計數闆沖洗幹淨，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗淨後自行晾幹或用吹風機吹幹，放入盒内保存。

三、細胞計數闆-計數公式

1、16格×25格的細胞計數闆計算公式：細胞數/ml=100小格内細胞個數/100×400×10000×稀釋倍數

1、25格×16格的細胞計數闆計算公式：細胞數/ml=80小格内細胞個數/80×400×10000×稀釋倍數

四、血細胞計數闆計數的誤差主要來自哪些方面?應如何盡量減少誤差,力求準确?

血細胞計數的誤差分别來源于技術誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利，器材處理、使用不當，稀釋不準确，細胞識别錯誤等因素所造成的誤差屬技術誤差；而由于儀器（計數闆、蓋片、吸管等）不夠準确與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細胞分布不均勻等因素帶來的細胞計數誤差屬于分布誤差或計數域誤差（filed error）。儀器誤差和分布誤差統稱為固有誤差或系統誤差。技術誤差和儀器誤差可通過規範操作、提高熟練程度和校正儀器而避免或糾正，但細胞分布誤差卻難于徹底消除。因此，搞好紅細胞計數的質量控制一般需采用以下措施。

1．避免技術誤差，糾正儀器誤差

（1）所用器材均應清潔幹燥，計數闆、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規格應符合要求或經過校正。①計數闆的鑒定：要求計數室的台面光滑、透明，劃線清晰，計數室劃線面積準确。必要時采用嚴格校正的目鏡測微計測量計數室的邊長與底面積，用微米千分尺測量計數室的深度。美國國家标準局（NBS）規定每個大方格邊長的誤差應小于1%，即1±0.01mm，深度誤差應小于2%，即0.1±0.002mm。若超過上述标準，應棄之不用。②血蓋片應具有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一緻，可使用卡尺多點測量（至少在9個點），不均勻度在0.002mm之内。必要時采用平面平行儀進行測量與評價，要求呈現密集平行的直線幹涉條紋。最簡單的評價方法是将潔淨的蓋片緊貼于幹燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時間不脫落，落下時呈弧線形旋轉，表示蓋片平整、厚薄均勻。同時，合格的蓋片放置在計數室表面後，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合後，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質量也符合要求。③目前臨床實驗室多采用一次性微量采血管采集毛細血管血，除注意定點購買使用信譽較好廠家的産品外，還應對每一批量的采血管進行抽樣檢查，可通過水銀稱重法或有色溶液比色法進行校正，誤差不應超過±1%。

（2）紅細胞稀釋液應等滲、新鮮、無雜質微粒。

（3）嚴格操作，從消毒、采血、稀釋、充池到計數都應規範，尤其應注意的是血樣稀釋及充池時既要作到充分混勻，又要防止劇烈震蕩為破壞紅細胞。必須一次性充滿計數室，防止産生氣泡，充入細胞懸液的量以不超過計數室台面與血蓋片之間的矩形邊緣為宜。

（4）報告法定計量單位。

2．縮小計數域誤差或分布誤差 由于血細胞在充入計數室後呈随機分布或稱Poisson分布（

），而我們所能計數的細胞分布範圍是有限的，由此造成的計數誤差稱為計數域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是盡量擴大細胞計數範圍和計數數目，一般先進行誤差估計，然後決定所需計數的數目和計數範圍，隻要能将誤差控制在允許範圍内即可。Berkson指出，當使用同一支吸管、同一面計數室，計數0.2mm2面積的細胞數，有望将 CV控制在可接受的7%以内。對于紅細胞計數而言，由于紅細胞數量較多，在計數室中顯得比較“擁擠”，根據Poisson公式推斷， 。欲将誤差控制在變異百分數5%以内，至少需要在計數室中計數400個紅細胞，因此要求計數五個中方格的紅細胞。事實上Berkson還通過實驗證明，紅細胞的計數域誤差為s=0.92 ，較理論誤差（Poisson分布誤差）要小。

3．排除異常标本的幹擾 白細胞數量在正常範圍時，相對于紅細胞數量來講，其影響可忽略，但如白細胞過高（>100×109/L），則應對計數結果進行校正。方法是：①實際RBC=計得RBC-WBC。如當紅細胞換算後為3.5×1012/L、白細胞換算後為100×109/L時，病人實際紅細胞數應為3.4×1012/L。②在高倍鏡下計數時，避開有核細胞。有核細胞體積比正常紅細胞大，中央無凹陷，無草黃色折光，可隐約見到細胞核。此外，當病人急性嚴重貧血時網織紅細胞可提前大量釋放，也給紅細胞計數帶來一定的幹擾，而且影響網織紅細胞絕對值計算結果。

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