一、菌株概念及傳代

（1）标準菌株：直接從官方菌種保藏機構獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認為第0代菌株。

（2）标準儲備菌株：将标準菌株在實驗室轉接一代後得到的一套完全相同的獨立菌株。通常為第1代或第2代菌株。

（3）儲備菌株：從标準儲備菌株轉接一代獲得的培養物。通常為第2代或第3代菌株。

（4）工作菌株：由标準儲備菌株、 儲備菌株或标準物質（經證明或未經證明） 轉接一代獲得的菌株。通常為第3-5代菌。

傳代：每一次的轉接培養都是一次傳代的過程，可以使用液體、固體或半固體培養基。

注意事項：菌株傳代隻能由上往下傳，儲備菌株可以做為工作菌株使用，但工作菌株不能做為儲備菌株使用。實驗室使用的工作菌株一般不可超過第5代，除非标準方法中有明确要求，或實驗室能夠證明菌株相關特性沒有改變。若在傳代過程中出現明顯變異，也不可繼續使用。

二、菌種保存的基本原理

使微生物的生命活動處于半永久性的休眠狀态，也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低範圍内。幹燥、低溫和隔絕空氣是保證獲得這種狀态的主要措施。有針對性地創造幹燥、低溫和隔絕空氣的外界條件，就是微生物菌種保藏的基本技術。

三、菌種保存的常用方法 （1）斜面保存法 操作方法：将營養瓊脂（或其他适宜的瓊脂培養基）加熱煮沸溶解後分裝至試管中，滅菌後擺長斜面凝固，挑取菌落“之”字形劃線接種至培養基斜面，置于合适的條件中進行培養。培養結束後，置2-8℃冷藏保存（部分菌株會在4℃産生自溶，如銅綠假單胞菌。副溶血性弧菌等，可置室溫保存）。 此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，操作簡單，使用方便，但易變異，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀，污染雜菌的機會亦較多。黴菌、酵母菌、放線菌和芽孢菌一般保存2-4個月傳代一次，細菌一般保存一個月傳代一次。

斜面保存法

（2）液體石蠟保存法 操作方法：将營養瓊脂（或其他适宜的瓊脂培養基）加熱煮沸溶解，分裝至試管中滅菌後擺長斜面，或使用半固體培養基加熱煮沸溶解後分裝至小試管，滅菌後擺直立，挑取菌落“之”字形劃線接種至培養基斜面或穿刺接種至半固體培養基管，置于合适的條件中進行培養。培養結束後，在培養基表面覆蓋一層無菌液體石蠟，2-8℃冷藏保存。 液體石蠟一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。此法比斜面保存法的保存期限更長，黴菌、酵母菌、放線菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更長時間，多數無芽孢菌也可保存到一年以上。（3）甘油凍存保存法 操作方法：挑取菌落至液體菌種保存管中（商品化的液體菌種保存管中已加入甘油，直接使用即可；若自行配制，可在凍存液中加入15%-50%比例的甘油，或将菌液與無菌甘油溶液混合），用移液槍吹打均勻，制成約109CFU/mL的菌懸液，置于超低溫冰箱中或液氮罐中冷凍保存（黴菌可挑取孢子凍存，保存溫度越低效果越好，長期保存建議在-70℃以下凍存）。 該方法适用範圍廣，操作簡便，效果好，無變異現象發生。-20℃保存時間較短，一般可保存一年左右，-70℃以下可保存較長時間，一般至少可保存兩年以上，有些菌種甚至可保存十年以上。注意事項：反複凍融易導緻菌株死亡，在中國藥典中規定，融化後的菌種保存管不可再進行冷凍保存。

液體菌種保存管（含甘油）

（4）真空冷凍幹燥保存法 通常以牛奶為載體，加入菌株制成菌懸液，使用真空凍幹機器進行脫水凍幹處理，制成凍幹粉。相比較于其他保存方法，真空冷凍保存法更容易保存菌種的活力，延長保存時間，适用于98%以上菌種的保存，但操作複雜，一般實驗室難以使用。 （5）載體保存法 以沙土、濾紙、矽膠等材料做為載體吸附菌株，通過五氧化二磷幹燥保藏的方法。保藏時間長，應用較為廣泛，但一般實驗室通常不易操作。 （6）瓷珠保存法 瓷珠菌種保存管是實驗室保存菌種的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于細菌的吸附和保存，甘油做為抗凍保護劑可減少冷凍過程中形成的冰晶，瓷珠菌種保存管放置于-20℃或-80℃下便可創造幹燥、低溫、缺營養的環境，使菌株處于“休眠” 狀态，方可長期保存（視不同菌種與保存溫度，一般可保存3-10 年），同時菌種保存管的取用和保存較為便利（取用複蘇及保存菌株僅需1 分鐘）。 保存方法：挑取平闆或斜面上的新鮮純培養物于菌種保存管中，配成大約3-4麥氏比濁度的菌懸液，蓋上蓋子來回颠倒幾次使細菌乳化，用無菌移液器将菌種保存管内的液體吸取幹淨，僅留下瓷珠，擰緊保存管，迅速将其置于-20℃或-70℃冰箱中。 使用方法：無菌條件下，用滅過菌的針或者鑷子取出一個小瓷珠，将小瓷珠直接用作平闆劃線或加到合适的液體培養基中，置合适的條件下進行培養即可。

瓷珠菌種保存管

四、實驗室常用菌種的保存方法

（1）短期、中期保存：葡萄球菌、沙門氏菌、埃希氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、假單胞菌、李斯特氏菌等，可使用營養瓊脂斜面或TSA斜面4℃保存（銅綠假單胞菌在4℃會出現自溶，可以置室溫保存），通常可保存1-3個月。白色念珠菌、酵母菌、黴菌等可使用沙氏葡萄糖瓊脂斜面4℃保存，通常可保存3-6個月。生孢梭菌、産氣莢膜梭菌可使用疱肉培養基培養後置4℃保存，可存活數月至1年以上。 （2）長期保存：對于大多數的細菌、真菌，普通實驗室都可以選用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下凍存，溫度越低保存時間越長。（注：保存黴菌時挑取孢子凍存即可；保存厭氧菌建議使用甘油保存法，避免反複凍融；使用甘油凍存法保存彎曲杆菌、螺杆菌、嗜血杆菌等細菌時，加入5%-10%比例的脫纖維羊血效果更佳）。

注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

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