【實驗目的】

（1）掌握酵母基因組DNA提取的原理。

（2）掌握酵母基因組DNA提取的方法及操作過程。

（3）熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作過程。

【實驗原理】酵母是單細胞真核生物，細胞膜外有細胞壁，抽提酵母基因組DNA的關鍵是破壞細胞外的細胞壁。酵母裂解酶（Zymolyase）或溶壁酶具有酵母細胞壁酶的活性，本方法采用蝸牛酶處理去除釀酒酵母細胞壁。去壁後的釀酒酵母細胞用SDS溶液處理，使細胞破裂，并使蛋白質變性，釋放基因組DNA，再利用乙酸鉀溶液低溫處理，使基因組DNA充分複性，溶解于水，最終通過乙醇沉澱獲得基因組DNA。這一方法避免使用酚和氯仿等有機溶劑，操作更為簡單、安全。

【實驗材料、試劑及儀器】

1．實驗材料釀酒酵母菌株CJY151（其他釀酒酵母菌株亦可）。

2．實驗試劑

（1）YPD培養基：1％酵母抽提物（yeast extract），2％蛋白胨（peptone），2％葡萄糖，低溫滅菌20min。

（2）20mg/mL Zymolyase（酵母裂解酶）溶液：購自日本Seikagaku公司或美國Sigma公司。（3）溶液A：1mol/L山梨糖醇，100mmol/L EDTA（pH8.0）。

（4）溶液B：250mmol/L EDTA（pH8.0），400mmol/L Tris-HCl（pH8.0），2％SDS。

（5）5mol/L KAc溶液：49.1g乙酸鉀溶解于100mL去離子水中，于4℃貯存。

（6）無水乙醇。

（7）70％乙醇：70mL無水乙醇用無菌水定容至100mL。

（8）含10μg/mL RNase A的TE緩沖液：10mL TE緩沖液［10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），121℃高壓滅菌20min，備用］中加入10mg/mL RNase A溶液10μL。

（9）TE緩沖液（pH7.5）：10mmol/L Tris-HCl（pH7.5），1mmol/L EDTA（pH 8.0），121℃高壓滅菌20min，備用。

（10）瓊脂糖凝膠電泳相關試劑。

3．實驗儀器

台式高速離心機（每8人1台）恒溫水浴鍋（每8人1台）1．5mL無菌離心管（每人4支）移液器（每2人1套）1mL和200μL無菌吸頭（每人10支）吸水紙（每4人1卷）瓊脂糖凝膠電泳相關儀器

【實驗步驟】

（1）接種釀酒酵母菌于5mL YPD液體培養基中，30℃振蕩培養36h以上，取1.5mL菌液，10000r/min離心2min，收集菌體，棄上清液。

（2）加入500μL溶液A，振蕩混勻。

（3）加入3μL20mg/mL Zymolyase溶液，37℃溫育1h後，5000r/min離心2min，棄上清液。（4）加入400μL TE緩沖液（pH7.5），吹打混勻後，5000r/min離心2min，棄上清液。

（5）菌體重懸于350μL TE緩沖液（pH7.5）中。

（6）加90μL溶液B，65℃水浴30min。

（7）加入80μL5mol/L KAc溶液，4℃靜置2h後，4℃、12000r/min離心5min。

（8）上清液轉移到1mL無水乙醇中，4℃、12000r/min離心5min，棄上清液。

（9）沉澱用0.4mL70％乙醇洗1次後，4℃、12000r/min離心5min，棄上清液。

（10）沉澱溶于40μL無菌水中，備用。

（11）如需去除産物中的RNA，可加入适量含10μg/mL RNase A的TE緩沖液，處理1h。

（12）取10μL樣品進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

【實驗注意事項】

【典型實驗結果分析】1．理想實驗結果（見圖5.2，泳道1）DNA分子大于23kb，條帶清晰，可直接用于後續的分子生物學操作。如果沒有進行去除RNA的操作，那麼在凝膠前端有較大量的RNA條帶。由于RNA的存在不影響後續分子生物學操作，因此在酵母基因組DNA抽提過程中，該步驟可以省略。

圖5.2　釀酒酵母基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果1M：DNA分子大小标準參照物；1～2：釀酒酵母基因組DNA（未去除RNA）

圖5.3　釀酒酵母基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果2

M：DNA分子大小标準參照物；1～2：釀酒酵母基因組DNA，均有一定程度的降解，其中1号孔的降解程度更嚴重2．典型實驗結果1（見圖5.3，泳道2）DNA分子大小正常，條帶也較清晰，但條帶的亮度較弱，表明DNA量較少。解決辦法：增加大腸杆菌細胞數量，重新提取。

3．典型實驗結果2（見圖5.3，泳道1）條帶彌散模糊，嚴重的會出現梯狀條帶，表明獲得的基因組DNA被降解。常見的原因有：操作過程中動作過于劇烈，導緻基因組DNA斷裂；用于去除RNA的RNase中混有DNase。解決辦法：重新提取DNA，

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