在銷售額方面，連續幾年單克隆抗體藥物在每年的銷售額排名中一直是占據着前幾名。有不下幾十種新mAb藥物産品和mAb生物仿制藥正在開發中，并且每一個單抗藥物都需要進行廣泛詳細的表征研究，以獲得臨床試驗所需的批準并最終投放市場。

歐洲藥品管理局（EMA）于2009年7月發布了有關mAb表征的監管文件。該EMA指南标題為“單克隆抗體及相關産品的開發，生産，表征和規格”。文件指出，研究者應詳細的研究單抗的表征mAb。單抗表征應包括根據國際協調會議（ICH）指南Q6B（3）确定mAb的理化和結構性質，純度，雜質等方面。

ICH Q6B為生物技術産品的表征提供了一套統一的國際公認原則，以支持單抗藥物的市場應用。該文件建議進行分析以提供有關生物或生物制藥産品的以下信息：

結構表征

1 氨基酸序列

2 氨基酸組成

3 末端氨基酸序列

4 肽圖

5 巯基和二硫鍵

6 糖基化結構

理化分析

1 分子量大小

2 異構體

3 消光系數（或摩爾吸收率）

4 電泳圖

5 液相色譜圖

6 光譜

下面我們一一讨論用于提供這些準則所需數據的分析技術。

氨基酸組成和消光系數測定

ICH Q6B指出：使用各種水解和分析方法确定氨基酸的總含量，并從所需産品或天然對應物的基因序列中推斷出氨基酸組成（如有必要）進行比較。在許多情況下，氨基酸成分分析提供了一些肽和小分子蛋白質的結構信息，但是對于大蛋白質來說，這些數據的确定性通常較差。在許多情況下，氨基酸定量分析數據也可用于确定蛋白質含量。

如今，使用反相高效液相色譜（RP-HPLC）和柱前衍生化技術進行氨基酸組成分析，或者采用柱後衍生化處理的離子交換色譜法來确定生物制藥産品的氨基酸組成。如果已知每摩爾蛋白質的氨基酸摩爾比和蛋白質的總分子量，則可以從産物水解物中檢測到的每種氨基酸的量而計算蛋白質含量。同樣，如果已知溶液的光密度（在280nm處）（用于分析氨基酸的等分試樣）是已知的，則根據比爾朗伯定律（吸光度[OD] =ε.cl；其中ε是消光性）系數，c是濃度（M/L）。

氨基酸序列和多肽測定

對于mAb，EMA指南和ICH Q6B要求通過适當的方法（例如，肽圖分析，氨基酸測序，質譜分析）從DNA序列中推導氨基酸序列，并通過實驗确認DNA衍生序列。另外，N-末端氨基酸序列（是否存在遊離氨基酸或焦谷氨酸）和C-末端氨基酸序列（例如，存在或不存在C-末端賴氨酸）的變異性，重鍊等）應進行分析。

肽圖分析（即使用mAb的特定蛋白酶消化酶，然後使用帶有紫外UV和電噴霧質譜檢測[LC/ES–MS的在線RP-HPLC分析産品）可提供有關分子量的信息。通過選擇的蛋白酶從而使得mAb釋放形成肽。獲得的數據能夠提供（或以其他方式）DNA衍生序列的确認，但不能提供mAb輕鍊和重鍊序列的确認。為了在一級氨基酸序列水平上提供确認，需要将許多蛋白酶消化物與在線RP-HPLC和串聯MS/MS（LC/ES-MS/MS）分析聯合使用。ICH Q6B實際上并不要求在一級氨基酸水平進行測序。但是，某些監管機構已采取了相應的行動規範。

由于質譜的測序無法（在大多數情況下）區分異亮氨酸和亮氨酸（這些氨基酸具有相同的分子量），因此要明确分配這兩個氨基酸，就需要對純化的肽在輕鍊和重鍊的可變區内進行自動N端測序。

末端氨基酸序列測定

進行末端氨基酸分析以鑒定mAb輕鍊和重鍊的氨基和羧基末端氨基酸序列。如果産品顯示一個以上的末端氨基酸序列，則應确定末端的相對量。

使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離輕鍊和重鍊後自動進行N末端測序，然後常規地印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，分析mAb輕鍊和重鍊的N-末端 。自動化的N末端測序使用Edman化學法，在切割N末端和随後的氨基酸之前，需要在蛋白質的N末端具有遊離的氨基官能團以進行标記。這意味着對于許多mAb（在N端有焦谷氨酸，因此沒有遊離氨基），使用此方法的末端測序将不提供序列信息。在這種情況下，焦谷氨酰胺酶可用于在N末端測序之前酶促除去N末端焦谷氨酸殘基。

沒有類似埃德曼化學法（Edman化學）的完全可靠的方法來确定生物産物的C末端氨基酸序列。可以使用羧肽酶消化或質譜圖策略獲得與肽或蛋白質C-末端序列有關的信息。在後一種方法中，可以使用從肽圖獲得的數據和産物的完整分子量分析來評估蛋白C末端的完整性或參差不齊的末端存在。

巯基和二硫鍵測定

在肽圖分析測序分析中，還應考慮遊離巯基和二硫鍵。用特定蛋白酶消化後的肽圖分析，然後在還原前/還原後使用在線LC/ES-MS或LC/ES-MS/MS分析，可提供全面評估二硫鍵和遊離基所需的mAb中的數據。在堿性pH值下消化含有遊離巯基的蛋白質時，必須小心，因為遊離硫會在消化液中引發幹擾，因此獲得的結果可能與産品中真正的二硫鍵/遊離巯基譜型不一緻。

單抗糖基化結構測定

由于mAb是糖蛋白，因此還必須表征每種産品的聚糖部分。通常，mAb 在恒定片段（Fc）區域的每條重鍊中都有一個N鍊聚糖共有序列（天冬酰胺– Xxx –絲氨酸或蘇氨酸，其中Xxx可以是脯氨酸以外的任何氨基酸）。mAb的輕鍊成分通常不會被糖基化。由于額外的N重鍊中可能存在連接的聚糖共有序列，應确認是否存在糖基化。ICH Q6B要求：對于糖蛋白，确定碳水化合物含量（中性糖，氨基糖和唾液酸）。此外，碳水化合物鍊的結構多肽鍊，寡糖模式（糖鍊分布）和糖基化位點盡可能分析。

如下圖1所示，通常進行單糖成分分析以确定mAb的碳水化合物含量。液相色譜和氣相色譜法（通常采用質譜檢測）通常用于定義mAb碳水化合物的含量。所使用的方法應允許鑒定和定量中性糖（岩藻糖，甘露糖和半乳糖），氨基糖（N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰半乳糖胺）和唾液酸（N-乙酰神經氨酸和N-羟乙酰神經氨酸）水平的産品在内。

圖1：用于分析單克隆抗體（mAb）糖基化的正常方法示意圖。LC是液相色譜，MS是質譜。

在單糖成分分析之後，下一步分析将進入通常存在于每個重鍊上的寡糖的表征。上圖1顯示了用于從mAb 裂解，純化和分析N-連接聚糖的方法學示例。

還原/烷基化和特定的蛋白酶消化旨在使mAb變性，以便相對較大的酶PNGase F可以有效去除N-連接的聚糖。一旦釋放了N-聚糖，就可以使用簡單的反相色譜柱将親水性聚糖與疏水性更高的肽分離。的N端連接的聚糖餾分可使用質譜法或基于液相色譜進行技術分析。

通過分析mAb釋放的N-聚糖（使用圖1中所示的方法）獲得的基質輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI–TOF）質譜圖如下圖2所示。觀察到的主要信号與常見的mAb聚糖G0F，G1F和G2F一緻（見下圖2）。

圖2：從mAb釋放的N-聚糖的基質輔助激光解吸電離飛行時間（Maldi-TOF）質譜分析獲得的原始數據。在分析之前将N-聚糖過甲基化。

通過分析從同一mAb産品釋放的N-聚糖獲得的具有脈沖安培檢測（HPAEC-PAD）痕迹的高pH陰離子交換色譜圖如下圖3所示。

圖3：從高pH值陰離子交換色譜法獲得的原始數據，并通過脈沖安培檢測分析（HPAEC-PAD）測出mAb釋放的N-聚糖。

兩組數據都可用于提供所觀察到的N-端連接寡糖的相對定量，并提示存在的N-連接聚糖的結構。糖基化是監管機構遇到的最常見的翻譯後修飾。監管機構意識到，即使在制造過程中發生簡單的變化，例如pH值變化或生長培養基的變化，糖基化也會受到顯着影響。單糖成分分析數據（以甘露糖基化，半乳糖基化和唾液酸水平計）監管機構将通過對各種批次的mAb産品進行分析而獲得的寡糖鍊分析數據用作評估制造商是否控制mAb制造過程的一部分。批次之間N-聚糖譜的可比性表明制造過程處于受控狀态。

光譜測定

EMA和ICH指南還建議，應通過适當的理化方法來表征mAb的更高級結構。ICH Q6B建議使用“圓二色譜，核磁共振（NMR）或其他合适的技術”。如今，圓二色譜（CD）分析通常用于評估mAb的二級結構。從mAb的CD分析獲得的數據如下圖4所示。使用CDsstr軟件評估原始數據可以估算各種二級結構的相對百分比，如下表I所示。

圖4：從mAb的近紫外（UV）分析獲得的原始數據。

表I：圖4所示的近UV CD（圓二色譜）數據的CDSSTR算法評估結果。

除了上面概述的結構特征要求外，還需要評估許多其他物理化學特性。

分子量大小

使用四極杆飛行時間（Q-TOF）儀器對完整和還原的mAb進行在線LC/ES-MS分析，徹底改變了mAb完整分子量以及釋放的輕鍊和重鍊的測量方法。使用此技術從mAb的完整分子量分析獲得的數據如下圖5所示。

圖5：通過在線電噴霧質譜檢測（飛行時間定量）mAb的LC/ES-MS（Q-TOF）分析獲得的去卷積質譜。

觀察到的主要峰相距162質量單位，這與存在于分子的重鍊上的N-連接的寡糖的半乳糖基化的變化一緻。還原後從mAb分析獲得的質譜數據如下圖6所示。

圖6A：通過mAb在線LC/ES-MS（Q-TOF）分析獲得的去卷積質譜。

上圖6A中所示的信号與輕鍊預期的信号一緻，并且下圖6B中觀察到的信号與具有預期的N-連接寡糖的重鍊預期的信号一緻。除了确定mAb的分子量以及輕鍊和重鍊成分外，這些數據還确認了蛋白質主鍊的完整性。

圖6B：還原後從mAb在線LC/ES-MS（Q-TOF）分析獲得的去卷積質譜。

異構體

以類似的方式，成像毛細管等電聚焦（cIEF）帶來了革命性的mAb異構體分析。cIEF在毛細管柱中是自由溶液的等電聚焦。諸如iCE280分析儀（Convergent Biosciences）之類的專用系統使用整個色譜柱紫外線吸收檢測器來檢測聚焦蛋白區域，從而避免幹擾這些區域的聚焦。這項技術的獨特之處在于它具有與傳統凝膠IEF相當的分辨率，但結合了基于柱的分離技術的優勢，包括定量（使用280nm的UV）和自動化。

從mAb的cIEF分析獲得的原始數據如下圖7所示。獲得的數據可準确确定每種異構體的pI，并基于UV峰面積對每種異構體進行定量。

圖7：單克隆抗體毛細管等電聚焦後獲得的毛細管的UV（280nm）響應。

電泳和液相色譜圖

通常使用等電聚焦（如上圖所述），SDS-PAGE（還原前後）和毛細管電泳對mAb進行分析，根據大小和電荷提供産品分布。

使用尺寸排阻色譜法（SEC），RP-HPLC和離子交換液相色譜法進行色譜分析可根據尺寸，親水性、疏水性和電荷分布提供産品表征分布。

電泳和色譜均提供有關産品身份，均質性和純度的信息，并且經常用于純化雜質，使用上述分析技術進行鑒定和結構表征。

蛋白質聚集

特别是對于mAb，必須使用多種方法評估每種産品中多聚體和聚體的存在。當前，監管機構通常要求使用多角度激光散射（SEC-MALS）和無柱技術（例如分析離心（AUC））對SEC進行交叉檢查，以對從SEC分析獲得的數據進行交叉檢查。

由于聚體可能會因與SEC色譜柱的非特異性結合而丢失，或者實際上可能由于色譜柱上産物的稀釋和剪切力作用而分散，因此需要使用無色譜柱技術确認SEC結果。

從mAb的SEC-MALS和AUC分析獲得的原始數據分别顯示在下圖8和9中顯示。在這種情況下，通過mAb的SEC-MALS分析獲得的數據表明存在低水平的聚體（約2.6％）。從AUC分析獲得的數據表明存在約5.0％的聚體。通常，使用AUC會比SEC-MALS觀察到更高的聚集水平，這可能是由于可能降低上述分析數據中的聚集水平的因素所緻。

圖8：通過大小排阻色譜對mAb進行多角度激光散射（SEC-MALS）分析獲得的原始數據。

圖9：通過mAb的分析離心（SV-AUC）分析獲得的原始數據。

結論

本文說明的技術用于整個産品有效期内的臨床前階段，以了解産品，以證明對制造過程的更改（例如按比例放大過程）不會改變産品的結構和理化性質，并提供數據以證明産品制造的一緻性。同樣，越來越多的特征分析技術（例如肽圖分析和寡糖分析）被用作批放行測試方案的一部分，以将産品放行到臨床中進行試驗并最終投放市場。在開發任何mAb産品的過程中，至少要進行三批（通常是幾批）的表征分析才能達到上述概述的程度。

總而言之，需要一系列分析技術來充分表征mAb産品。此外，要提交給監管機構，還需要對GLP和cGMP進行分析和驗證。現在可以在幾周内完成根據EMA和ICH指南對mAb進行全面鑒定，并且儀器的不斷改進使分析實驗室能夠以更高的靈敏度，準确性和分辨率獲得數據。分析的挑戰始終站在這些技術的最前沿，并納入越來越多的其他适當的技術，例如傅立葉變換紅外（FT-IR）分析，以補充使用CD和二級結構分析，從而進行适當的彙總和總結。

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