實時熒光定量pcr原理和結果分析?一、實驗器材及試劑1、 實驗器材，今天小編就來聊一聊關于實時熒光定量pcr原理和結果分析?接下來我們就一起去研究一下吧!

實時熒光定量pcr原理和結果分析

一、實驗器材及試劑

1、 實驗器材

• 多樣品研磨珠均質儀
• 台式高速冷凍型微量離心機
• 熒光定量PCR儀
• 超淨工作台
• 分光光度計
• 離心管
• TIP頭

2、 主要實驗試劑及耗材

RNA提取液

三氯甲烷

異丙醇

無水乙醇

HyPure TMMolecular Biology Grade Water

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit

FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)

引物

75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制

離心管、TIP頭均購濕熱滅菌40min，幹燥。

二、熒光定量PCR實驗步驟

1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預冷。

2）取100mg組織，加入到勻漿器中。

3）充分研磨直至無可見組織塊。

4）12000rpm離心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。

6）4℃ 下12000rpm離心10min。

7）将上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，颠倒混勻。

8）-20℃ 放置15min。

9）4℃下12000rpm離心10min，管底的白色沉澱即為RNA。

10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉澱。

11）4℃下12000rpm離心5min。

12）将液體吸除幹淨，将離心管置于超淨台上吹3min。

13）加入15μl無RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃ 孵育5min。

15)使用UV1800檢測RNA濃度及純度：儀器空白調零後取2.5μl 待測RNA溶液于檢測基座上，放下樣品臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測。

16）将濃度過高的RNA進行适當比例的稀釋，使其終濃度為200ng/μl.左右。

2、反轉錄（槍頭和PCR均經過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl 逆轉錄引物。

3）用無核糖核酸酶的去離子水補足至12μl。

4）于PCR儀上65℃ 保溫5min，迅速置冰上冷卻。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉錄酶，用槍抽吸混勻。

6）于PCR儀上42℃保溫60min，結束後80℃保溫5min滅活反轉錄酶。

3、定量PCR

1）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄産物配制3管。

2× qPCR Mix12.5μl

7.5μM基因引物2.0μl

反轉錄産物2.5μl

ddH2O8.0μl

2）PCR擴增

預變性95℃，10min

循環（40次） 95℃，15s→60℃，60s

熔解曲線75℃→95℃，每20s升溫1℃

4、結果處理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(内标基因，待測樣本)

B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(内标基因，對照樣本)

K=A-B

表達倍數=2-K

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