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*本文首發于“納米酶Nanozymes”公衆号，2021年7月15日

*編輯：俞紀元

引言

大家好，今天分享一篇發表在Chem. Sci.上的文章<Bound oxygen-atom transfer endows peroxidase-mimic M-N-C with high substrate selectivity>。本文通訊作者是東南大學化學化工學院張袁健教授，他們組(https://Zhang.team)的主要研究方向是Carbosensing-基于富碳材料的分子傳感。

結合态氧原子轉移機制：

M-N-C選擇性催化氧化類過氧化物酶底物

文章簡介

數萬年的自然演化賦予了天然酶高活性、高底物選擇性的精巧結構，然而其分離/純化成本高昂，極端條件下易失活。為此，納米酶作為一類既有納米材料理化特性，又蘊含酶學催化功能的新一代人工模拟酶應運而生，其中，如何提高納米酶的底物選擇性是該領域面臨的巨大挑戰和重要科學問題。本文以生命分析化學中的兩個重要反應3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）和3-氨基鄰苯二甲酰肼（Luminol）的催化氧化為研究模型，發現通過調節氮配位過渡金屬摻雜碳（M-N-C）的金屬配位中心可将其類過氧化物酶底物選擇性顯著提高至200倍。機理研究表明，在N配位金屬位點形成結合态氧中間體（M=O）是H2O2連續活化及随後底物以高選擇性方式氧化的關鍵，并且嵌于剛性石墨結構的N配位金屬位點較天然辣根過氧化物酶（HRP）具有更高的底物選擇性。這種結合态中間體機制與常見的自由态活性氧中間體（ROS）機制截然不同，對于開發高底物選擇性的納米酶具有重要的啟示作用。

圖文解析

圖1 M-N-C納米結構及分子結構表征：Fe-N-C納米酶的（a）TEM及（b）HAADF-STEM圖像；Fe-N-C及參考樣品在Fe K-edge的（c）FT-EXAFS圖譜及（d）XANES圖譜

M-N-C納米酶通過經典的高溫熱解結合酸蝕刻的方法制得，TEM結果（圖1a）表明，尺寸約50 nm的無規則納米顆粒狀Fe-N-C主要由兩部分組成，一是載體炭黑（CB）呈渦輪狀的多層石墨結構；二是鄰苯二胺聚合物熱解生成的包覆于CB的片層碳，并且未從TEM圖像中觀察到任何金屬晶相。分辨率可達亞埃級的HAADF-STEM研究證明了Fe-N-C納米酶中的金屬以單原子形式存在且均勻分布于碳基底（圖1b）。Fe K-edge的XAFS譜進一步探究了Fe-N-C納米酶中Fe的配位結構和價态，Fe-N-C和Fe箔的FT-EXAFS圖譜如圖1c所示，Fe箔在2.19Å處呈現出明顯Fe-Fe峰，而Fe-N-C納米酶不存在該峰，進一步證明了Fe-N-C納米酶中的Fe以原子級形式存在；另外Fe-N-C納米酶位于1.76 Å處的主峰證明了存在Fe-N配位。從XANES圖譜（圖1d）可見，Fe-N-C的吸收邊位于FeO和Fe2O3的吸收邊之間，表明Fe-N-C中Fe的價态介于 2與 3之間。Fe-N-C的其他結構信息及其他M-N-C（M = Mn、Co、Ni、Cu）的結構特征見原文。

圖2 M-N-C、N-C、CB及HRP催化類過氧化物酶反應的底物選擇性研究：（a）催化TMB氧化的反應方程式及M-N-C、N-C、CB、HRP催化TMB氧化顯色的照片；（c）20 mg mL-1 M-N-C、N-C及CB在0.1 M HAc-NaAc水溶液（pH 3.6）中催化100 mM H2O2氧化1 mM TMB的反應初速率；（b）Luminol催化氧化的反應方程式及M-N-C、N-C、CB、HRP催化luminol氧化發光的照片；（d）50 μg mL-1 M-N-C、N-C及CB在0.01 M NaOH水溶液中催化250 mM H2O2氧化2.5 mM luminol的最強發光強度（425 nm）

H2O2氧化TMB與luminol是類過氧化物酶性質研究的兩個經典反應模型，本文以這兩個模型反應為案例，探究了M-N-C催化類過氧化物酶反應的底物選擇性。首先，本文研究了M-N-C、N-C及CB在HAc-NaAc水溶液（pH 3.6）中催化H2O2氧化TMB的性能，如圖2a所示，除CB外，M-N-C及N-C均可催化TMB氧化産生藍色的氧化産物，且Fe-N-C催化反應所得顔色較其他更深，因此Fe-N-C活性最為突出。進一步通過紫外可見吸光度法測試了M-N-C、N-C及CB催化TMB氧化産物在652 nm處的動力學曲線，計算得到了該反應的初速率（圖2c），可見Fe-N-C納米酶的催化速率可達6.08 μM s-1，遠高于其他納米酶，尤其是Co-N-C。

進一步通過檢測luminol化學發光（CL）強度研究了M-N-C、N-C、CB及HRP在NaOH溶液中催化H2O2氧化luminol的活性。由圖2b中照片可見，僅在Co-N-C和HRP催化反應中出現了明顯的肉眼可見的CL信号。通過光纖光譜儀的時序圖程序測定催化過程中luminol在425 nm處的特征發射峰的動力學曲線可量化CL強度（圖2d），同樣，區别于Co-N-C，其他M-N-C、N-C及CB未檢測到明顯的光信号。由于M-N-C具有類似的粒子尺寸、形貌及碳結晶度，因此作者推測M-N配位中心對于類過氧化物酶底物選擇性催化起着至關重要的作用。

圖3 （a）ROS清除劑對Fe-N-C催化H2O2氧化TMB的影響；（b）Fe-N-C H2O2 ROS自旋捕獲劑的ESR圖譜；（c）HRP H2O2 ROS自旋捕獲劑的ESR圖譜；（d）110 K測得的Fe-N-C及120 ℃真空脫氣處理36 h所得Fe-N-C的ESR圖譜

鑒于TMB及luminol均是可被H2O2活化生成的活性氧自由基（ROS）氧化的底物，為了探究Fe-N-C及Co-N-C催化H2O2氧化這兩個底物的内在機制，本文首先通過自由基清除實驗研究了H2O2活化過程産生的自由基類型。以Fe-N-C催化TMB氧化反應為例，如圖3a所示，當催化體系中分别加入超氧化物歧化酶（SOD）及甘露醇（Mannitol）以清除反應中可能産生的超氧及羟基自由基時，未觀察到該催化反應活性受影響，因此推測該反應不涉及這兩種自由基。随後本文進一步通過電子自旋共振（ESR）圖譜研究了反應涉及的ROS（圖3b），同樣證明Fe-N-C催化活化H2O2過程中沒有産生單線态氧、超氧及羟基自由基，該過程與HRP催化機制類似（圖3c）。原位監測反應過程中涉及的Fe=O的生成與消耗對于研究Fe-N-C催化H2O2氧化TMB的機制至關重要但也存在巨大挑戰，本文通過非原位的方法研究了Fe-N-C與含氧基團之間存在相互作用，如圖3d所示，Fe-N-C經真空加熱處理後，Fe的特征峰明顯減弱，側面反應了Fe與O之間存在相互作用。

圖4 （a）TMB氧化體系中Fe-N-C及Co-N-C催化第一分子H2O2的能量圖及相應的反應構型；（b）luminol氧化體系中Fe-N-C及Co-N-C催化第一分子HO2-的能量圖及相應的反應構型；其中IS、MS及TS分别指代初始态、中間态及過渡态

TMB氧化體系中，Fe-N-C及Co-N-C催化第一分子H2O2的能量圖及相應的反應構型如圖4a所示，H2O2吸附于Fe-N-C、Co-N-C的Eads分别為-0.16 eV和-0.13 eV，說明H2O2吸附于Fe-N-C較Co-N-C略穩定；從過渡态構型可見，随後在Fe-N-C及Co-N-C作用下H2O2均發生了O-O斷鍵，并且Fe-N-C體系的活化能（Ea）很低（0.08 eV），而Co-N-C體系的Ea相對較高（0.94 eV），因此Fe-N-C相較于Co-N-C更易催化O-O斷鍵，這可能是導緻二者活性巨大差異的核心因素。

Luminol氧化體系中，Fe-N-C及Co-N-C催化第一分子HO2-的能量圖及相應的反應構型如圖4d所示，HO2-吸附于Fe-N-C、Co-N-C的Eads分别為-1.38 eV和-1.18 eV，說明HO2-吸附于Fe-N-C較Co-N-C略穩定；從過渡态構型可見，随後HO2-在Fe-N-C作用下發生了O-O斷鍵，而在Co-N-C作用下O-O鍵明顯變長，并且Fe-N-C催化HO2-的Ea（1.64 eV）明顯高于Co-N-C體系的Ea（0.81 eV），因此Co-N-C相較于Fe-N-C更易活化HO2-産生M=O。

圖5 （a）Fe-N-C催化H2O2氧化TMB的反應機理；（b）Co-N-C催化HO2-氧化TMB的反應機理

因此，論文作者提出了M-N-C類過氧化物酶底物選擇性的機理。簡而言之，在TMB氧化體系中，H2O2首先吸附于Fe-N-C中N配位的FeIII；然後，被吸附H2O2發生O-O斷鍵，FeIII氧化至FeV=O并釋放出H2O分子；後續是否發生底物氧化抑或H2O2歧化取決于二者的供電子能力大小。同樣，在luminol氧化體系中，HO2-首先吸附于Co-N-C中N配位CoII；然後，被吸附HO2-發生O-O斷鍵，CoII氧化至CoIV=O并釋放出OH-；後續是否發生底物氧化抑或HO2-歧化取決于二者的供電子能力大小。更多信息參見原文。

結論與展望

綜上所述，本文提出通過改變M-N-C活性中心的金屬類型可以實現催化底物選擇性氧化，該選擇性源于反應過程中在氮配位過渡金屬上形成了結合态氧中間體（M=O）。以Fe-N-C和Co-N-C為例，得益于二者氮配位金屬中心的d軌道差異，其催化TMB與luminol氧化的選擇性高達200倍；并且，M-N-C在催化類過氧化物酶反應中表現出的高底物選擇性甚至優于天然酶HRP，這可能由于M-N-C的金屬配體嵌于剛性石墨骨架所制。實驗和基于簡化模型的DFT計算均證明，M-N配位中心是M-N-C催化類過氧化物酶底物選擇性氧化的來源，決定活化H2O2的能力強弱及生成後續氧轉移反應的M=O活性中間體；另外，底物與M=O活性中間體作用的結合能及其供電子能力也決定着反應選擇性。值得注意的是，結合态M=O中間體催化機制與已報道的大多數類過氧化物酶的遊離ROS中間體機制完全不同，這對開發下一代具有高底物選擇性納米酶具有重要的指導意義。此外，這項工作還強調了借鑒天然酶催化機制并結合納米材料結構特征可模拟并在某些方面超越天然酶的功能，進而實現生物學所無法完成的更高級應用。

原文：Xinghua Chen, Lufang Zhao, Kaiqing Wu, Hong Yang, Qing Zhou, Yuan Xu, Yongjun Zheng, Yanfei Shen, Songqin Liu, Yuanjian Zhang*, Bound Oxygen-Atom Transfer Endowing Peroxidase-Mimic M-N-C with High Substrate Selectivity. Chem. Sci. 2021, 12, 8865-8871 (Chem Sci Pick of the Week).

撰稿：陳興華 審閱：王權

編輯：周逸夫

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