作者：米粒兒

克羅恩病是一種原因不明的腸道炎症性疾病，今天跟大家分享的這篇論文主要關注克羅恩病。揭示缺氧環境對腸道炎症保護的分子機制。缺氧調節自噬和核苷酸結合低聚體結構域類似受體熱蛋白結構域(NLRP)3，本文作者證明缺氧可通過自噬途徑和(mTOR)/NLRP3通路減輕結腸炎發病過程中的炎症。

缺氧可顯著性的降低腫瘤緻死因子α，白介素-6和NLRP3表達，并且提高自噬蛋白p62翻轉。在體外，缺氧引發的自噬降低NF-κB和NLRP3的表達。同時，作者也證明NLRP3可作為mTOR的結合蛋白。

二甲基草酰甘氨酸 調節的羟化酶抑制可改善小鼠結膜炎，下調NLRP3，促進自噬。因此可發現，缺氧通過降低mTOR和 NLRP3的結合以及激活自噬減輕炎症。

下邊我們看一下作者是如何得到這些結論的。

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缺氧降低克羅恩病人體内炎症相關基因表達

為了研究缺氧環境對結腸炎症的影響，作者模拟了海拔4000m的缺氧環境，并将正常人和炎性腸疾病患者暴露于以上缺氧環境3h後。結果顯示克羅恩病患者體内NLRP3和TNFα表達量明顯升高，而IL-1β和IL-6的mRNA水平并未見顯著變化。而潰瘍性結腸炎患者中未見此效應（Fig.1a-d）。

缺氧處理後（1周/2周）後，NLRP3，TNFα和IL-6的mRNA水平顯著降低。而且缺氧造成的炎症相關因子降低現象與自噬相關p62表達升高同時發生（Fig.1e）。免疫組化結果也顯示缺氧處理後p62表達顯著改變。

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缺氧可降低葡聚糖硫酸鈉誘導的炎症基因表達

為了進一步驗證缺氧環境對炎症影響和NLRP3在缺氧調節中的作用，WT和NLRP3^-/-小鼠經2%葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理後，暴露于常氧或者缺氧環境18h。葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理後，WT和NLRP3^-/-小鼠體内炎症調節因子TNFα，IL-6，IL-1β，NLRP3的mRNA水平升高（Fig.2a-d）。

而經缺氧處理後，TNFα，IL-6，IL-1β，NLRP3的mRNA水平在WT小鼠中顯著降低，而在NLRP3^-/-小鼠中未見明顯改變。該結果證明，NLRP3在缺氧調節的抑制作用中發揮重要作用。同時，缺氧也可誘導WT和NLRP3^-/-小鼠中自噬相關蛋白p62和LC3的表達（Fig.2f-g）。

采用缺氧marker VEGF的表達來确認實驗中的缺氧環境。在常氧環境中，DSS處理的小鼠中，NF-κB 亞基p65/RelA磷酸化水平與p62表達量同時提高（Fig.2h）。在WT小鼠中，缺氧能夠逆轉DSS誘導的p65//RelA磷酸化和NLRP3表達。

并且可以降低mTOR磷酸化水平，p62的降解，增加LC3-II/LC3-I，從而修複細胞自噬（Fig.2h）。有意思的是，NLRP3^-/-小鼠中，mTOR磷酸化水平降低，并且對缺氧環境無響應，說明NLRP3在自噬調控中的作用。

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在IL-10-/-小鼠中缺氧導緻炎症基因表達降低

接下來，我們試圖确認在小鼠直腸炎模型IL-10^-/-中确認缺氧對抗炎症效應的影響，WT，IL-10^-/-，Nlrp3^-/-和IL-10^-/-/Nlrp3^-/-雙敲除的小鼠模型分别暴露于常氧/缺氧環境中18h。在常氧環境中，IL-10-/-小鼠中TNFα, IL-6, IL1β 和 Nlrp3的mRNA水平表達上升，而在缺氧環境中表達下降，同時p62表達也上升（Fig3a-f）。缺氧環境中LC3的mRNA水平也上升（Fig3g）。

在常氧環境中，與lrp3^-/-和IL-10^-/-/Nlrp3^-/-雙敲除的小鼠模型相比，IL-10^-/-小鼠中，p65/RelA磷酸化，mTOR磷酸化，p62和LC3的水平都有所上升（Fig3h）。這一結果提示

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在IECs中，缺氧導緻NLRP3降解和自噬激活

接下來，作者試圖揭示缺氧對結腸粘膜的保護機制。首先，作者将IEC細胞系HT-29暴露于缺氧狀态，同時設置LPS暴露組和非暴露組。HIF-1α在缺氧後6h含量達到最高。

NF-κB 亞基p65/RelA磷酸化持續激活，且NF-κB上遊抑制因子IκBα表達也被逆轉，自噬也激活。同時，缺氧導緻LPS誘導的NLRP3表達降低（Fig. 4a）和p62 mRNA表達升高。

同樣的，缺氧導緻NLRP3 mRNA在6和18h瞬時表達升高（Fig.4c）。NLRP3蛋白水平在蛋白酶體抑制劑MG132存在時表達量也下降，表明缺氧導緻的NLRP3水平降低并非通過蛋白酶體機制（Fig.4e）。

有意思的是，在蛋白酶體抑制劑存在的情況下，缺氧可逆轉泛素化蛋白積累，表明缺氧環境下，替代蛋白降解機制例如自噬被激活（Fig.4e）。

在獲得了缺氧調節p62和NLRP3後，作者試圖揭示p62和NLRP3的轉錄調節分子機制。通過p62啟動子的序列分析獲得了HIF-1α 和p65/RelA可能的結合位點（Fig.4f）。如圖Fig.4g所示，p65/RelA的結合位點為NLRP3啟動子的-468位點，HIF-1α的結合位點為NLRP3啟動子的-150位點。

作者采用ChIP實驗研究轉錄因子與p62和NLRP3啟動因子的結合活性。ChIP實驗結果顯示缺氧處理6h後，HIF-1α與p62啟動子的結合能力增強，說明HIF-1α在缺氧條件下可誘導p62表達（Fig.4f）。而NF-κB 與p62啟動子結合能力基本不變（Fig.4g）。

相反的，由于在未缺氧處理細胞中NLRP3并沒有持續性表達，因此，作者觀察到NF-κB 與NLRP3啟動子持續性結合。但是盡管在缺氧過程中HIF-1α含量增加，但是HIF-1α在NLRP3啟動子上并沒有富集。

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在IECs中，缺氧通過抑制NF-κB通路調節自噬

在HT-29細胞中，溶酶體的生物合成和積累可采用LysoTracker Yellow-HCK-123檢測。缺氧可誘導溶酶體的積累，更進一步證明在低氧水平下自噬激活。Fig.5a檢測線粒體活化水平。

為了探讨缺氧調節自噬和炎症保護之間的因果關系，在氯喹（自噬晚期抑制劑，阻止帶有溶酶體的自噬體溶解）存在情況下，HT-29細胞暴露于缺氧環境。缺氧24h後，自噬激活 (Fig. 5b)，缺氧引起的p62降解關閉，p65/RelA磷酸化水平下降也非觀察到（Fig. 5c）. 這些結果表明缺氧引發的自噬對下遊促炎信号通路非常重要。相反的，缺氧仍然可以降低NLRP3蛋白表達 (Fig. 5c), 表明自噬并不調節NLRP3降解。

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缺氧降低NLRP3與mTOR的靶向結合

接下來，作者試圖探讨NLRP3在自噬調節中的作用。作者在HT-29細胞中轉染NLRP3-特異性siRNA，敲除NLRP3之後，mTOR磷酸化水平降低，基礎自噬水平升高(Fig. 6a), 表明NLRP3通過促進mTOR 磷酸化持續性抑制細胞自噬。而且，Co-IP實驗也證明NLRP3是mTOR直接作用靶點，而在缺氧環境下這一直接作用被抑制 (Fig. 6b)。

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DMOG 減輕DSS引發的結腸炎，降低NLRP3表達，促進自噬

為了研究HIF-1α穩定性對缺氧調節的抗炎效應的影響，WT小鼠暴露于2% DSS和羟化酶抑制劑DMOG。DMOG通過模拟缺氧環境抑制羟化酶活性激活HIF通路，可引起HIF-1α穩定和反式激活。DMOG和DSS同時處理的小鼠結腸炎病情得到明顯緩解(Fig. 7a-7e)。

DMOG可降低DSS誘導的TNF-α，IL-6，IL-1β 和NLRP3 mRNA水平(Fig. 7g–j),并且增加自噬蛋白p62表達(Fig. 7l)，LC3表達也升高（Fig.7m）。在蛋白水平，DMOG處理的小鼠NF-κB 磷酸化和NLRP3水平降低，并且激活自噬 (Fig. 7n)。

參考文獻：Hypoxia ameliorates intestinal inflammation through NLRP3/mTOR downregulation and autophagy activation

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