随着全球經濟的發展，進口貿易的增多，食品安全檢測也日趨嚴格。常用于食品安全檢測的聚合酶鍊式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術，是目前大部分檢測機構及醫學實驗室都在使用的常規技術。

然而該技術需要昂貴且精密的控溫設備，耗費較長時間，在現場檢測中不具備優勢，因此，我們需要更加簡便的技術來提高檢測效率。

等溫核酸擴增技術的問世為現場快速檢測帶來新的曙光。今天給大家介紹下先達基因的酶促恒溫擴增技術 (ERA)。

本文對酶促恒溫核酸擴增技術及其應用進行綜述。ERA 技術全稱酶促恒溫核酸擴增技術，是聚合酶鍊式反應(PCR)的一種替代品，也是一種全新的升級，可準确、快速、便攜地進行核酸檢測分析。

ERA 與 PCR 擴增一樣具有特異性，但速度快得多，結果通常在 5～ 10 min 生成。而且與 PCR 不同的是，ERA 反應不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環設備。ERA對操作溫度要求并不嚴格，反應在 37～42℃的溫度下工作最優，比其他等溫擴增技術需要的溫度要低，能在廣泛的環境溫度下工作。

ERA可以在多種應用中取代PCR，如傳染病診斷、食品安全檢測、水産畜牧疫病檢測等等，它非常适合于現場、護理點和其他設備缺乏的環境，特别是對于檢測速度需求較高的情況下。

一、ERA 技術介紹

1、反應原理

酶促恒溫擴增技術（ERA技術）是先達基因公司團隊研發的具有全球自主知識産權等溫核酸擴增技術，将來源于細菌，病毒和噬菌體的特定工具酶進行改造突變并篩選其功能，通過不同的核酸擴增反應體系進行優化組合，從而獲得核心的酶促恒溫擴增體系。

模拟生物體遺傳物質自身擴增複制的原理，通過蛋白定向進化、DNA與核酶親和力成熟等技術對重組酶、核酸内切酶、DNA聚合酶等多酶體系進行改造，建立ERA擴增反應體系，使之将單分子DNA/RNA的特異性區段在5-10分鐘内擴增10^9倍。

2、引物設計

ERA 引物設計原則：

(1) 引物長度最長是 35 bp，最好為 29～32bp，過短會影響重組酶活性。

(2) 5’端開頭核苷酸最好是胞嘧啶，能促進擴增片段的重組，5’端避免出現3 到 5 個連續的聚鳥嘌呤。

(3) 3’端最好為胞嘧啶和鳥嘌呤，有助于聚合酶的穩定結合提升引物擴增性能。

(4) 引物中避免出現特殊序列，如避免出現回文序列和連續的重複結構。

(5) 引物設計時盡量避免容易形成發夾結構的序列，減少引物二聚體的形成。

(6) GC 含量過高(>60%)或過低(<40%)都不利于 ERA 擴增。

3、技術特點

ERA 技術與傳統的 PCR 擴增相比在便捷性以及高效性上有顯著的優勢，與 PCR 技術相比有以下特點：

（1）反應能夠在恒溫條件下進行。盡管 ERA 的反應模式與 PCR 相似，但不同的是 PCR 反應需要加熱使 DNA 模闆變性，而 ERA 不需要，在 37～42℃的條件下，利用重組酶引物複合體掃描雙鍊 DNA，促使 DNA 鍊上同源位點的互換。

（2）耗時短。ERA 反應速度快，能在 5～10 min 完成檢測。在許多情況下，沒有經過專門訓練的人就可以采集樣本，進行實驗，并在半小時内得到結果。檢測速度遠勝于其他等溫擴增技術。

（3）操作簡單。ERA 擴增的基礎體系含有 DNA 擴增所需的所有試劑，隻需加入引物和模闆就可以反應，不需要複雜的樣品前處理，這大大提高了操作效率，避免繁瑣的實驗步驟帶來可能性的誤差。

（4）不受場地的限制。PCR 擴增需要專門的 PCR 儀，ERA 技術由于對溫度要求低，甚至可以用人體溫度進行，并可以在條件較為簡陋的地方進行檢測。

（5）高靈敏性。在複雜樣品中，ERA 技術可以檢測單拷貝的 DNA 和幾十個或更少拷貝數的 RNA 分子，而不需要事先進行核酸純化和富集。

4、操作過程

含有重組酶及聚合酶幹粉的反應管中分别加入反應緩沖液、上下遊引物以及模闆 DNA，用純水補至總體積，充分混勻，加入激活劑，上下颠倒 8～10 次混合均勻，瞬時離心後，可上機反應。

二、ERA 及衍生技術

1、基礎型核酸擴增ERA法

基礎型核酸擴增ERA法是一種快速、靈敏的檢測方法。該技術不需要複雜的樣品前處理環節，常溫下就能夠對樣品中的目标基因進行擴增，簡化了過程分析，在 15～20 min 的反應時長内能完成實驗要求，遠低于其他等溫擴增技術的時長要求。它既不需要 PCR 所依賴的熱循環儀器,也不像環介導等溫擴增技術(LAMP)需要提前準備預變性的模闆。

基礎型核酸擴增ERA法具有快速、靈敏、簡單等優點，是 ERA 系列技術的基礎，最後的産物可用瓊脂糖凝膠電泳等終點法進行結果檢測。

2、實時熒光型核酸擴增ERA法

實時熒光型核酸擴增ERA，是 ERA 基礎反應體系與熒光探針結合起來的一種聯用技術。與熒光 PCR 比較，兩者具有相同的靈敏度與特異性，然而實時熒光ERA 的檢測過程所需時間明顯短于實時熒光 PCR，即實時熒光ERA法所需時間是 10～15 min，實時熒光PCR 則需耗時約 90 min，且PCR 的實驗操作設備較複雜、昂貴，而且所占空間大、不便攜帶。

此外，實時熒光 PCR 不僅需要一個熱循環過程而且實驗操作步驟複雜，而實時熒光ERA法實驗操作溫度在 37～42 ℃ 的恒溫條件下就可進行，不需複雜的操作程序。用雙标記寡核苷酸探針檢測目标擴增，該探針的 5’末端含有熒光基團 （Tamra 或 FAM)，3’末端含有淬滅基團。當探針與被擴增的靶 DNA 結合時，外切酶切割基本位點，熒光基團和淬滅基團被分離，從而産生出與擴增目标 DNA 數量成正比的熒光信号，熒光強度也會随着其擴增而增強。熒光強度信号實時檢測由熒光信号檢測器或掃描儀完成，該試劑可配合先達基因生産的熒光恒溫擴增儀GS8使用，實現恒溫擴增與熒光信号檢測于一體。

該技術敏感性強、特異性高，檢測時間短，已有不少用戶利用該技術建立呼吸道病原快速檢測的方法。

3、 試紙型核酸擴增ERA法

ERA技術與試紙條側向層析技術相結合，建立一種快速靈敏的現場檢測系統。實現了利用側向層析試紙條作為終點法對核酸擴增産物進行快速檢測。該方法中引物用生物素進行了标記和探針用FAM 或FITC進行了标記，擴增産物結合到包埋有對應抗體的試紙條上并顯色，從而實現檢測。該方法無需特定檢測設備，操作簡單，能夠快速直觀獲得檢測結果。

試紙型ERA法檢測結果能在橫向流動試紙條上顯示，裸眼便可觀察，即使是非專業人員也可以直接分析結果，非常适用于現場快速檢測，尤其在經濟條件差資源缺乏的區域，具有更好的應用前景。

4、酶促擴增酶聯免疫吸附技術(ERA-ELISA)

酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)是抗原抗體的特異性反應，指将可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應的定性和定量方法。

ERA-ELISA 技術是在 ERA 技術的基礎上結合 ELISA 技術發展起來的用于檢測核酸擴增産物的新型分析檢測手段，綜合了 ERA、ELISA 兩種技術的特點，在特異性、靈敏性等方面表現出優異的特點、而且操作過程簡單，結果不需要電泳檢測和 ERA 産物純化，較短時間内可以完成整個檢測過程。

同時，能在數小時内對大量待檢樣品進行篩選和鑒定，适用于資源匮乏的現場快速檢測是一種有效的聯用檢測技術。

三、ERA 技術在食品安全檢測領域的應用

目前，ERA技術在涉及食品安全檢測方面已有多項産品，并且在快速便捷檢測等方面優于 PCR 檢測。ERA 技術在食品安全領域的應用主要包括緻病微生物、動物源性成分及轉基因成分檢測等方面。

1、食源性緻病菌的 ERA 檢測

沙門氏菌是引起世界各地食源性疾病暴發的最常見病原，許多流行病學調查将沙門氏菌爆發的源頭歸咎于家禽和家禽副産品，包括蛋類。先達基因建立了一種快速檢測沙門氏菌的熒光檢測方法，在 37～42 ℃下，僅需要 10 min 的擴增就能達到擴增子的檢測阈值。

大量擴增後的産物能夠與帶有熒光标記的探針相結合，從而産生特定的熒光。該熒光信号可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環情況。樣品中如果具有微量的沙門氏菌DNA存在時，則能夠通過大量擴增後激發熒光信号，樣本顯示為陽性；如果樣本中不含有沙門氏菌，儀器會判讀為陰性。由此可見，ERA技術能夠為食源性緻病菌的檢測提供一種簡便的方法。

該方法具有良好的特異性和較高的靈敏度。且不需要昂貴的設備，可作為野外條件下食物中沙門氏菌的檢測試劑盒。

同時，先達基因還生産有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌、李斯特氏菌、霍亂弧菌等一系類食品緻病菌檢測試劑盒。

2、肉類摻假檢測

肉類食品是人們生活中最重要的生鮮類食品之一，随着生活水平的提高，對肉品質的需要也越來越高，近年來，國内外市場上的肉制品摻假事件頻繁發生，這些不法行為不僅破壞了公平貿易，給消費者帶來經濟損失，更重要的是引起了宗教信仰、食品安全等方面的問題。

先達基因科技有限公司自主開發的核酸檢測技術實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，可對各類肉源性成分核酸特異基因片段進行擴增及定性檢測，通過實時擴增曲線，在短時間内判斷樣品中是否含有其肉源性成分。ERA技術在動物源性檢測方面具有簡單高效等優點，為市售生鮮肉制品摻假提供了快速便捷的檢測方法。

3、轉基因檢測

随着轉基因技術的不斷發展，其在農業技術方面的應用也越來越廣泛，轉基因食品也走向市場， 在轉基因食品的監測方面，監管部門也面臨越來越大的壓力。

先達基因自主開發的核酸檢測技術實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，可對轉基因農作物PAT基因片段進行擴增及定性檢測，通過實時擴增曲線，在短時間内判斷樣品中是否含有轉基因農作物PAT基因成分。該方法可在 15～25 min 可靠地檢測出樣品中的 100 個拷貝的目标分子。這種新的擴增方法大大縮短了檢測時間，簡化了反應過程，為轉基因作物的快速檢測提供了一種快速有效的方法。

本産品可用于食品生産加工企業對産品中潛在的轉基因農作物PAT基因進行快速檢測與篩查；國家、地方食品藥品監督管理單位對抽樣食品中潛在的轉基因農作物NOS基因進行快速檢測；重大活動中的食品安全保障；食品安全突發事件中的快速檢測等。

這種現場檢測方法同樣适用于未經訓練的人員對樣品進行快速簡單的測試。ERA技術為轉基因食品的檢測提供了快速便捷的方法。

04、結論

ERA 恒溫擴增技術具有許多優點。這種反應沒有熱循環的需要，可使用簡單設備，如小型加熱器等，價格低廉，可以進行最低限度的維護控制。具體來說，ERA 具有恒溫、較低溫度、擴增時間短、可靠性和簡單性等特點。核酸擴增産物的測定還具有靈敏度高等優點，在食品安全核酸檢測領域具有一定的應用價值。

它提供了一種能夠檢測潛在食物威脅因素的方法，如過摻假肉、轉基因生物或病原體。傳統檢測技術由于耗時長，設備複雜，因此不利于現場快速檢測，已不能滿足食品安全檢測的更高需求，因此建立一種快速便攜、靈敏、特異的檢測方法十分重要。ERA 作為一個新興的分子檢測技術， 迄今為止，不僅在醫藥學等方面應用較多，而且在食品安全檢測方面的研究也初有成效，随着 ERA 技術不斷地應用與研發，未來 ERA 将朝更加快速、便攜、敏感、特異的方向發展，給食品安全檢測的研究帶來新的方向

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!