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β-Actin與GAPDH内參真的那麼靠譜嗎？

哪種内參最靠譜？

免疫印迹（Western blot, WB）是分子生物學中檢測複雜生物提取物中特定蛋白質存在的最常用方法之一。WB必須控制上樣量以确保目标蛋白變化具有可比性，通常選擇在所有組織中普遍分布的具有相對恒定量的蛋白質作為内參（Loading control）。

内參與其上樣量應該如何确定？哪種内參最靠譜？

常用内參抗體分子量及其定位情況如下：

文獻報道總蛋白上樣量超過10 μg時内參蛋白不夠敏感，無法檢測到差異：

所以一般情況下内參的理想上樣量為大約5μg。對于目标蛋白的上樣量，其理想的上樣量為為10-20μg：

GAPDH是一種定位于細胞質的常用内參，使用HeLa細胞裂解液上樣10-50μg，結果發現不同上樣量GAPDH幾乎無變化：

為了測試上述發現是否為普遍現象，将HzAm1細胞裂解液（覆蓋了WB分析中的大部分蛋白質）上樣4-40μg，PVDF膜ECL顯色結果驚奇的發現上樣總蛋白質超過4μg時β-Actin條帶無明顯增加：

為了達到數據标準化的目的，現在諸多SCI期刊審稿人要求每個目标蛋白條帶同一張膜上均需孵育内參。然而，從上述β-Actin與GAPDH的結果來看我們有理由懷疑這一要求的合理性！

因此我們使用抗TCTP（翻譯控制的腫瘤蛋白）抗體和抗GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）抗體用于評估這一廣泛接受的做法。結果顯示TCTP與GSK-3β信号強度随着上樣量增加幾乎成線性關系，而此時β-Actin随着上樣量增加幾乎無變化：

因此，上述結果說明使用β-Actin重新探測相同的膜以達到數據标準化的目的的傳統做法應該受到質疑。那麼為什麼會出現上述現象呢？

這種現象可歸因于β-Actin的豐度，β-Actin豐度遠遠高于細胞中的大多數其他蛋白質。結果導緻β-Actin經常超載，特别是在檢測低豐度蛋白質時無法區分蛋白質上樣量的差異。為了确認β-Actin的适用範圍，在低于4μg的範圍内連續稀釋樣品進行分析（方形折線為理論含量，圓形折線為實際檢測情況）：

結果顯示在在0.7-1.9μg範圍内，β-Actin的條帶強度逐漸增加，這與蛋白質上樣量非常匹配。在2.2-40μg的總蛋白範圍内沒有觀察到β-Actin明顯的條帶強度變化，以上結果說明随着上樣量在該範圍内的增加，實際值和理論值之間的差異變得越來越顯著。例如，當總蛋白上樣量增加到40μg時，其差異超過10倍。

針對上述問題有人提出了一些解決方法，例如使用麗春紅染色（Ponceau staining）或考馬斯亮藍染色（Coomassie staining）替代β-Actin進行數據标準化。當然也有文獻這麼做，例如：

麗春紅染色和考馬斯亮藍染色作為内參的優點是不依賴于單個蛋白質作為内參，因此消除了特定條件下單個管家蛋白的變化的影響。

然而這些方法仍然存在許多問題，麗春紅染色總蛋白的光密度值近似線性高達140μg，馬斯亮藍染色高達20μg，然而，實際蛋白上樣量遠高于理論值，這将縮小甚至減小樣品之間蛋白質水平的倍數變化。

此外，由于麗春紅染色強度的高度時間依賴性染色和考馬斯亮藍染色的硝化纖維素膜上的高背景，複現性差也降低了它們作為内參的吸引力。

Stain-free總蛋白定量是一種新興的總蛋白歸一化方法，該方法通過直接對每一條泳道的所有蛋白質進行定量避免了各種内參的局限性。與麗春紅染色和考馬斯亮藍染色相比，Stain-free總蛋白定量結果更接近理論值，因此強烈推薦此方法！

在此我們使用Stain-free總蛋白定量方法來定量大鼠心髒勻漿中的總蛋白，結果表明Stain-free總蛋白定量準确反映了每個通道中的蛋白質量，可作為WB的可靠内參：

上圖Stain-Free™免染膠購自Bio-Rad公司，有興趣的朋友可以自行查找。接下來對WB檢測到的蛋白酶體亞基Rpt1的進行歸一化，歸一化後Rpt1無變化：

肝髒裂解物(10-45μg) Stain free gel使用紫外活化2分鐘後與麗春紅S染色液相比Stain free法定量更加準确：

值得注意的是Stain free轉膜後的NC膜成像時必須在濕潤條件下進行，否則獲得的圖像質量明顯較差：

綜上所述，内參抗體在線性範圍内才能夠很好的反應蛋白上樣量，因此上樣量無論對于内參還是目标蛋白均很重要。Stain-free總蛋白定量方法由于其準确性與便捷性，可作為我們WB内參定量的金标準！希望今天的分享對大家有所幫助，謝謝大家！

參考文獻：

1. Chen, W. & Xu, W. H. β-Actin as a loading control: Less than 2 μg of total protein should be loaded. Electrophoresis 36, 2046–2049 (2015).

2. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics 17, (2017).

3. Gilda J.E., Gomes A.V. (2015) Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Stain-Free Technology. In: Posch A. (eds) Proteomic Profiling. Methods in Molecular Biology, vol 1295. Humana Press, New York, NY.

4. Gilda, J. E. & Gomes, A. V. Stain-Free total protein staining is a superior loading control to b-actin for Western blots. Analytical Biochemistry 440, 186–188 (2013).

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