大家都知道使用工具病毒感染動物組織時工具病毒的載體選擇、注射方法和用量非常重要，往往都要反複跟我們确認，生怕選的不合适導緻實驗失敗。但在病毒注射後進行效果檢測時，卻顯得非常随意，等到實驗結果不好時來咨詢才發現在樣本處理或檢測方法上出了問題。浪費了時間和樣本不說，嚴重的可能導緻原本應有的陽性結果得不到而錯過一篇SCI。

本文我們總結了樣本處理及檢測中容易犯錯的四個步驟供參考，希望能幫助大家獲得更好的實驗結果，避免因一時失誤使自己的實驗倒在黎明的前夕。

一、心髒灌流

動物的血液具有很強的自發熒光，在檢測熒光信号時會導緻很強的背景産生，此外血液還會影響組織蛋白提取液的吸光度，造成蛋白濃度測量不準确而導緻WB中内參蛋白條帶不均一。所以一般在取組織樣本進行檢測前都要進行心髒灌流，即利用生理鹽水或PBS洗去血管中的血液，從而排除血液對後期免疫熒光、WB等實驗的影響。而在心髒灌流時，我們需要注意：

A、一定要等到動物徹底麻醉（掐四肢或肌肉無任何反應）後方可進行灌流，若麻醉不徹底，動物抖動會影響進針角度及位置，可能造成灌流不徹底；

B、 灌流速度要先快後慢，若後續隻做切片染色則可繼續有4%多聚甲醛灌流，若做WB則隻用生理鹽水或PBS即可；

C、不用4%多聚甲醛時要注意結束後快速取材（像腦組織容易液化，影響樣本質量），若操作較慢可将灌流液先放4℃冰箱中預冷并在冰上進行取材操作。

二、組織處理

若樣本用于蛋白或RNA抽提，則建議樣本取出後接着就提取蛋白或RNA（樣本中磷酸化蛋白水平等随時間變化明顯），如不能立馬提取需第一時間液氮速凍并存于-80℃冰箱中。

若樣本要冰凍切片用于後期熒光檢測或免疫熒光實驗等，則需要立即進行梯度脫水處理。

三、組織脫水

組織進行冰凍切片前需要用蔗糖溶液進行脫水以去除組織中的水分，從而防止在冰凍時形成冰晶刺破細胞破壞正常細胞形态等，在脫水處理過程中需注意：

A、不可将組織樣本直接置于高濃度的蔗糖溶液中，以免表面脫水速度過快，導緻組織萎縮且中間部分脫水不徹底，需先置于低濃度（20%）蔗糖溶液中，沉底後再換成高濃度（30%）蔗糖溶液使得徹底脫水；

B、 蔗糖溶液長時間存放極易被細菌污染，可能會使得蔗糖濃度變低而導緻脫水效果不佳，所以一般建議現用現配。

四、熒光檢測

病毒載體所帶熒光蛋白表達情況代表了病毒的感染及表達效率，因此熒光檢測往往是研究者首先要做的，且一般都直接将組織切片置于熒光顯微鏡下觀察，看不到熒光就認定病毒無效，甚至把樣本丢掉重新來過。這是萬萬不可的，因為：

A、一般冰凍切片獲得的組織切片可以直接觀察熒光，而石蠟切片得到的組織切片則需要用熒光蛋白抗體進行染色後才能觀察的到；

B、 即便冰凍切片的組織，也可能因為固定時間太久、所用溶液pH值等問題導緻熒光淬滅，如綠色熒光遇酸易淬滅，所以需要用熒光抗體染色做進一步确認。

本文來源于“吉凱基因”，brainnews獲授權發布。

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