蛋白質的分離純化說白了就是從衆多雜蛋白中以最溫和的條件、最少的步驟、最高的收率、最高的純度回收我們的目的蛋白。為了達到如上目的，兼顧收率及純度我們需要綜合分析待純化蛋白的基本性質：如等電點、疏水性、是否具備鍊内鍊間二硫鍵、是否有蛋白标簽以及标簽是否暴露等等。知道了上述目的蛋白參數後即可從衆多的純化方法中選擇我們所需要的一種和幾種來分離目的蛋白；

1）蛋白質的分離純化方法

沉澱法（特别常用鹽析法、等電點沉澱法、有機溶劑沉澱法）、膜分離法（超濾法、透析法）、色譜法、離心分離法等。每類方法有其自己的特點和适用範圍。如粗提常用沉澱法，精提就不會用沉澱法。這些方法中，應用最廣的是色譜法。

色譜法，在生化和醫藥行業叫層析。但中國化學會、中科院相關部門及有關期刊都規定要叫色譜。在國家有關色譜名詞術語的國家标準中 “ chromatography ” 一詞翻譯成 “ 色譜 ” 。故在此我們将柱分離叫色譜。柱内的分離介質一般也叫填料、固定相。

在蛋白質色譜純化中最重要的是分離介質和色譜條件的選擇。有些從事分離工作的人，拿到樣品後常不知道怎麼辦。其實這兩者的選擇隻要根據分離對象和每種色譜的分離機理來考慮，就可以自行設計分離方案。蛋白質分離介質的選擇應從蛋白質分子結構入手考慮。

2）基于蛋白質分子的結構的凝膠過濾尺寸排阻SEC的方法

蛋白質分子量大，都在 6kD 以上，是由多個氨基酸按一定序列通過肽鍵組合成肽鍊，再由一個或多個肽鍊通過共價鍵和非共價鍵組合成有複雜三級、四級結構的蛋白質分子。蛋白質還可能與糖、脂及核酸結合得到結合蛋白，不同的結合蛋白在性質上會有差異。蛋白質的外形為球狀和纖維狀，其大小因其分子量不同差異很大。故可以用排阻色譜、超濾和膜法分離大小不同的蛋白質。

使用的色譜介質時要注意其合适的分子量适用範圍。

一般的介質都是多孔的，多孔介質的比表面有 90%~95% 是在孔内。分離時充分利用孔内表面，柱容量才能大。所以要根據樣品分子量選擇具有合适的孔的介質。在排阻色譜中孔的大小用排阻極限表示；其他色譜用分子量适用範圍表示，實際是其基質的排阻極限。

常用的蛋白質分離介質是瓊脂糖和葡聚糖系列。瓊脂糖的分子量适用範圍取決于制備時瓊脂糖的濃度，大家熟悉的 4B ，糖的濃度是 4% ，适用 60kDa ~20000kD 分子量； 6B 糖的濃度是 6% ，适用 10kDa ~1000kDa 分子量。葡聚糖系列的分離範圍要看産品說明書，從幾千到上千萬不等（需注意的是，由于某些葡聚糖基質的填料剛性較差，人工裝填分子篩時尤其要注意設置恒壓裝柱以及裝柱操作細緻，否則該基質的分子篩很難達到理想的塔闆數）。

常用的矽膠系列孔徑有用于小分子的 6~12nm ；有用于一定分子量蛋白質的 30 、 50 、100nm 。

3）基于蛋白質帶電性的離子交換層析的方法

蛋白質與氨基酸一樣，會兩性離解，在不同的 pH 下形成正離子或負離子，蛋白質也有等電點。在相同的 pH 下，不同的蛋白質表面帶電情況不一樣，故可以用離子交換色譜分離蛋白質。

首先需要選擇陰離子或陽離子介質，如果目的蛋白的等電點已知，選擇陰離子介質且操作的pH高于目的蛋白的pI，或選擇陽離子介質且操作pH低于目的蛋白的pI。如果靶蛋白的pI未知，開始之前最好先測定它。最佳操作pH可根據經驗确定。因為大多數蛋白質的pI低于7，選擇陰離子交換和操作pH為8.5開始是合理的，然後根據估計結果和優化條件。知道蛋白質溶液中污染物pI和結合特征也是有用的。

常見的離子交換問題及解決方案

4）基于蛋白質的氨基酸殘基的疏水性的解決方法

蛋白質的氨基酸殘基會有一些苯基、烷基等疏水性基團，這些疏水側鍊在水相中會盡可能避開水相而藏于蛋白質分子内部，形成蛋白質分子外部親水性基團多，疏水性基團多在蛋白質裂隙内部的情況，在不同條件下蛋白質裂隙會有不同的伸展而暴露出内部的疏水基團。在同一個介質中，不同蛋白質表面的疏水性不同，可以用疏水相互作用色譜和反相色譜分離。

一般而言，離子強度（鹽濃度）越高，物質所形成的疏水鍵越強。影響疏水作用的因素包括：鹽濃度，溫度，pH，表面活化劑和有機溶劑。疏水層析的應用與離子交換層析的應用剛好互補，因此，可以用于分離離子交換層析很難或不能分離的物質。

但是需要注意，疏水層析一般都需要較高的鹽離子濃度以使目的蛋白與層析填料結合，使用該方法需确定目的蛋白能夠耐受至少0.5M以上的硫酸铵或者其他鹽濃度；

5）其他親和層析

生物大分子有一個特性，某些分子或基團對它們有特異性很強的吸附作用。這種作用隻針對一種或一類目标物質。如鎳NI與6*His标簽的結合作用、谷胱甘肽過氧化物酶與還原性谷胱甘肽、抗體特異性吸附抗原，苯甲脒對含絲氨酸的蛋白質有吸附作用。這就是親和色譜的應用原理 , 一般的小分子是不會有這種特異性吸附作用的。

6）純化中要特别注意保持樣品的生物活性

蛋白質有複雜的三級、四級結構，熱、光和化學品會導緻其理化性質改變和生理活性喪失，這叫失活。失活有可逆和不可逆兩種。不可逆失活的蛋白質常是固體，不溶于水和溶劑，不再具有蛋白質原有的生理性質。可逆失活的蛋白質可用不同的複性方法恢複其原有的生理活性。

蛋白質在選擇和評價分離純化的方法、介質和色譜條件時，不僅要注意樣品的質量回收率，還特别要重視活性回收率。要保持樣品的生物活性，在分離方法、填料、色譜條件和操作工藝上要注意。

在排阻、離子交換、疏水和反相、親和四類色譜中，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制備；其他的色譜方法，隻要條件選擇合适，都可以得到高的活性回收率。

蛋白質的三維結構

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