一、摘要

生物模闆仿生合成的介孔磷酸锆通過表征測試證明有良好的性能。以革蘭氏陽性茵(G )、蘋蘭氏陰性菌(G一)和酵母屬真菌等10種微生物作為供試茵，抑菌圈試驗(定性)和細胞總數測定實驗(定量)作為實驗方法研究了介孔磷酸锆的抗菌性，并探讨影響其抗菌性的因素和抗茵機理。實驗結果顯示，介孔磷酸锆對其中的8種茵具有明顯的抑菌效果，但對各種茵的抗茵能力表現差異性。說明介孔磷酸锆具有較好的廣譜抗菌性，将有廣闊的應用前景。

磷酸鉻是一類具有較好的熱穩定性與良好的耐酸堿性能的材料，介孔磷酸锆類化合物成為當前研究的熱點。介孔磷酸锆在其結構上可以分為α-ZrP和γ-ZrP兩種結構類型，目前合成的大多數為α-ZrP，主要由于α型磷酸锆具有較好的催化及插層等性能，在催化、生物、光學、電學、環境保護等領域具有廣闊的應用前景。在衆多功能中，介孔磷酸锆材料本身具有的抗菌性能尚未見報道。載銀磷酸锆複台材料的抗菌性僅以大腸杆菌、金黃色葡萄球菌作為供試菌。

二、實驗部分

1、試菌及培養基

供試菌(括号内為編号)

革蘭氏陽性菌(G )：短乳酸杆菌(DR)、有害片球菌(PQ)、枯草杆菌(KC)、金黃色葡萄球菌(JH)；

孳蘭氏陰性菌(G－)：酶蟹盛(CS)，硫狀菌(LZ)、大酶汗菌(DC);

酵母：啤酒酵母(303)，糖化酵母(TH，酵母屬野生酵母)、假絲酵母(JS，非酵母屬野生酵母)。

培養基(括号内為編号和培養的菌株)

麥汁液體／瓊脂培養基(MZ.啤酒酵母303、糖化酵母、假絲酵母)、MRS液體／瓊脂S培養基(MRS,有害片球菌、短乳酸杆菌、硫狀菌)、營養肉湯液體／瓊脂培養基(YR,枯草芽孢杆菌、醋酸菌、金黃色葡萄球蘊)、LB液體／瓊脂培養基(LB，大腸杆菌)。

2、原材料

酵母模闆仿生合成的介孔磷酸锫，綿竹耀隆化工有限公司提供。

3、抗菌性測試

首先定性的(抑菌圈法)研究介孔磷酸锆的抗菌性，然後定量的考察抗菌性能的強度及影響抗菌性的因素。

菌懸液制備

在無菌操作條件下，分别挑取一環斜面培養供試菌接種于相應的液體培養基中，恒溫培養箱25～37℃(每種供試菌有相應的溫度)培養24h，已滅菌的生理鹽水梯度稀釋，調整菌懸液的濃度為106～107cfu／mL，備用。

抑菌圈法

将滅菌的的瓊脂培養基加熱融化，倒入已滅菌的培養皿中，制成平闆。瓊脂凝固冷卻後取1ml。将菌懸液置于平闆上，用三角玻璃刮塗布均勻，把多餘菌懸液小心吸出，靜置幾分鐘。設置空白對照。将培養皿置于26～37℃的恒溫培養箱中，24h後，遊标卡尺測量試樣周圍抑菌圈的大小，以抑菌圈直徑的平均值作為評價材料抗菌性能的依據。

細胞總數測定法

細菌數量的測定，采用菌落計數法。通過測定參比樣與抗菌材料處理樣中細菌數量的增減來評價材料的抗菌性能。将菌懸液裝入滅菌的錐形瓶中，加入一定量的介孔磷酸锆，再将錐形瓶置于氣浴恒溫振蕩器中，2s～37℃培養一段時間後，測量剩餘的活細菌總數。每個供試菌另有一瓶不加抗菌材料作為對照組。此方法以滅菌率作為指标定量評價材料的抗菌性能，計算公式如下：滅菌率=(實驗前的活菌數-實驗後的活菌數)／實驗前的活菌數×100％(1)

三、結果與讨論

抑菌圈試驗

酵母和細菌在培養皿中能夠迅速生長，形成一層分布均勻的菌苔，但加入抗菌材料後酵母和細菌在其周圍很難生長，在抗菌材料的周圍會出現清晰透明的抑菌圈。抑菌圈直徑越大表明材料的抗菌效果越好，反之則越差。

介孔磷酸锫對10種供試菌的抑菌圈試驗結果如表l和圖l所示。可以看出。303、TH、JS、KC、DC、JH表現出明顯的抑菌圈，平均直徑在12mm左右；PQ、Cs也有抑菌圈出現，但不是很明顯DR、LZ則沒有抑菌圈。這說明，介孔磷酸锆對303、TH、JS、KC、DC、JH有較強的抑制作用，對PQ、CS表現出抑制效果但相對較弱，對DR、LZ沒有抑制作用。從而定性的證明了介孔磷酸锆有抗菌性能，且對菌種具有選擇性。

細胞總數測定

表2結果顯示：介孔磷酸锆添加量為0.75g／L時，作用8h，DC滅菌率達99．99％，8h以上可以全部殺滅；作用12h，303、TH、JS、KC、JH平均滅菌率達96％，16h為100％；作用24h，CS、PQ滅菌率為98％。添加量為1.25g／L，時，僅作用4h，DC滅菌率就達99.96％，8h為100％；作用8h，303、TH、JS、KC、JH滅菌率97％以上，16h時全部殺滅，此時CS、PQ滅菌率也達到90％。添加量為2.50時，作用4h，DC滅菌率是100％；303、TH、JS、KC、JH達到99％以上，8h是滅菌率100％；CS、PQ在16h時達到99.87％，24h為100％。從實驗結果可知，介孔磷酸锆對DC殺滅作用最強，對303、THJS、KC、JH有較好的殺滅效果，但對CS、PQ在12h内效果不明顯。添加量為0.75g／L，作用12h，介孔磷酸锆對酵母和多數細菌有理想的滅菌效果。

影響抗菌性的因素

影響介孔磷酸锆的抗菌性的因素有很多，本實驗考察了以下4個影響因素：

（1）、制備工藝

反應物的濃度、模闆量和熱處理溫度等因素對介孔材料的性能有着重要的影響。把比表面積作為目标參數，選擇正交表L16(45)來設計正交實驗。比表面積(BET)的測定可知酵母量和煅燒溫度對結構性能影響最大，其他作用較小。正交試驗結果顯示磷酸锆最佳合成條件：酵母量0.4g，煅燒溫度300℃，磷源濃度0.2mol／L，锆源濃度0.1mol／L，pH值=l。抑菌試驗結果表明此結構的樣品抗菌性能最好。

（2）、添加量和作用時間

表2實驗結果表明，加大添加量，延長作用時間。滅菌率随之增高。但不同菌種對抗菌材料的敏感性不同，所以要根據菌種選擇合适的添加量和作用時間。另外，在抑菌圈實驗(圖2)中發現，DC在恒溫培養24h以後，抑菌圈内重新出現小菌落，并且随着時間逐漸擴大和增多，這說明介孔磷酸锆隻是暫時抑制了DC的生長和繁殖，一旦抑制作用解除DC會重新生長。這種現象可能是因為部分DC在作用過程中對抑菌因子産生了“抗性”逐漸适應了新環境，同時水分的消耗妨礙抑菌因子的釋放和抑制作用的發揮，菌落周圍環境的抑制因子減少，抑制力減弱。

（3）、茵懸液濃度

菌懸液濃度是影響抗菌效果的一個重要因素。在一定範圍内，菌懸液濃度對實驗結果分析影響不大，較低濃度不能很好顯示抗菌材料的抑菌能力，過高的濃度則可能超出抗菌材料的抑制能力，不能表現其抑菌效果。一般菌懸液濃度取106～107 cfu／mL。

（4）、材料狀态

實驗表明，介孔磷酸锆粉末表現出良好的抑菌效果，但相同條件下介孔磷酸锆壓片抑菌效果較差，且作用時間較長，對一些供試菌甚至沒有表現出抑菌性能(圖3)。可能是因為高壓擠壓破壞了介孔磷酸锆的孔結構，孔徑變小或堵塞，抑菌因子釋放速度放緩或不能釋放，對供試菌解除了抑制作用。

四、抗菌機理

納米金屬離子抗菌劑的抗菌作用屬于被動式抗菌，通常情況下通過離子溶出後接觸微生物來發揮抗菌作用。目前普遍認可的兩種機理是接觸反應機理和活性氧機理。

接觸反應機理是金屬離子通過液體溶出接觸到微生物細胞，金屬離子所帶正電荷與微生物細胞膜所帶負電荷中和，并在适當的條件下，通過微生物膜上某些具有運輸功能的酶被轉移到微生物機體内部，與機體内的蛋白質等物質發生反應，破壞了細胞内容物的結構和功能，造成微生物的生理系統障礙，抑制其正常生長甚至最終使其死亡。

活性氧機理認為．金屬離子抗菌劑與微生物菌體接觸以後，溶出的微量金屬元素分布在抗菌劑表面會形成一個催化氧化活性中心。産生的強氧化還原性. OH和O2-損壞微生物的細胞成分，妨礙新陳代謝正常進行，抑制其生長繁殖，從而達到抑菌、殺菌的效果。

介孔磷酸锆屬于納米金屬離子抗菌劑，其抗菌過程可以分為4個階段：同微生物接觸；同細胞膜相互作用并引起膜的透化；胞内殺死階段；微生物死亡。锫離子同微生物接觸是抑菌或殺菌過程的一個必要條件。锆離子與細胞膜接觸後破壞了細胞膜的完整性同時造成内容物的洩露。這是介孔磷酸锆發揮抗菌作用最重要的過程之一。微生物細胞膜的通透性能允許锆離子進入細胞内部與重要功能分子反應。锆離子可能使DNA不再随機分布在核區，而是在核區濃縮成緊張态，破壞了DNA分子的複制能力，從而影響遺傳物質正常的複制及生物體的繁殖；可能通過影響細胞的信号轉導而使微生物不能正常地存活；可能通過産生自由基，進一步氧化細胞外膜使微生物死亡；極微小的粒徑，可以進入微生物并與細胞中酶蛋白的巯基結合，使一些含巯基基團的酶失去活性；等等。總之，無論是破壞膜結構還是幹擾内部代謝活動，或者幾種效應相互作用，微生物的生長繁殖受到抑制，甚至完整的生命結構不複存在了，都會造成微生物的死亡。

五、結論

采用最優工藝，酵母模闆仿生合成的介孔磷酸锆具有良好的廣譜抗菌性。其抗菌性微生物具有選擇性且抗菌效果表現出差異性。介孔磷酸锆的制備條件、添加量、存在狀态、作用時間、菌懸液濃度等試驗因素明顯影響其抗菌性。目前，還沒有有關磷酸锆抗菌性能的深入的研究，本方法對其抗菌機理做了初步分析，确定主要經過4個階段達到抑菌或滅菌效果。作為一種新型納米無機抗菌劑，介孔磷酸锆在生物領域環境保護領域将有廣闊的應用前景，抗菌機理及其應用将是以後研究的重點。

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