根據遊戲背景，紐約市地下管道裡四隻功夫高強的忍者神龜和他們的老師斯普林特，為了保衛城市家園，同狡猾的巴克斯特·斯多克曼博士、紫龍幫的壞蛋以及一夥神秘且訓練有素的忍者（史萊德的部下）展開殊死搏鬥。
這四隻神氣十足的小烏龜，有手執忍者刀的、武士棒的、雙截棍和鋼叉的，英勇團結，不畏邪惡，與反派鬥争着，性格也迥然各異，它們以知名藝術家、科學家的名字命名（是當時老鼠老師以文藝複興時期四位大師的名字命名的），分别是他們的領導者達芬奇、暴躁沖動卻富有激情的拉斐爾，最愛搞笑的米開朗基羅和個性沉穩的多納泰羅。
遊戲人物的哲學—達·芬奇（藍龜）：從需要一個領導開始，就去盡力去做大家的領導，是一個對管理者感興趣的烏龜。非常注重忍術，因此努力去訓練自己，時常也會讀一些兵法的書籍，在我的家人需要的時候，為他們盡一份力。
拉斐爾（紅龜）：是個“堕落”的、憤世嫉俗的悲觀者，很容易發火的年輕人！讨厭主動挑釁别人，但如果有人來惹我，我一定會讓他們好看！
米開朗琪羅（橙龜）：算是一個自戀狂，也是一個享受生活樂趣的烏龜，樂趣恒生，生活是自己創造的，所以要活得痛快！幸福隻是生活的過程，而不是目的地。
多納泰羅（紫龜）：是神龜中的天才。喜歡獨立思考，樂于助人。有很多做不完的事情，感覺時間總是不夠用。是一個掉鍊子的忍者戰士，也是一個和平主義者！但不幸的是，命運往往不會讓你來選擇！
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