1、核酸序列依賴性擴增法,NASBA是由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術。反應在 42 ℃進行 ,可在2h内将RNA模闆擴增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。整個反應分非循環相和循環相:在非循環相中,引物I與模闆RNA退火後在AMV逆轉錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ與cDNA 退火, 在反轉錄酶作用下合成第2條DNA互補鍊。雙鍊DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經其啟動子序列起動而轉錄RNA,RNA又可在反轉錄酶的作用下反轉錄成DNA,進入循環相,對模闆進行大量擴增。
2、轉錄介導的擴增技術,TMA技術原理與NASBA基本一緻,略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶,MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應在41.5 ℃進行,可在1h内将RNA模闆擴增約109倍。
3、連接酶酶促鍊式反應(LCR),LCR是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術,是繼PCR後新發展的一種較有前景的體外擴增技術。它的原理就是由2段寡核苷酸單鍊DNA探針與目标序列雜交,當該2段DNA探針與沒有發生突變的模闆褪火後,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來,連接以後的新鍊又可以作為模闆,引導下一周期的連接産生新的子鍊。若連接區段發生核苷酸的堿基突變,則連接反應不能發生,擴增反應終止。
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