1.作為基因工程表達載體，隻需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什麼？

答：不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和标記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：

（1）生物之間進行基因交流，隻有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；

（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，隻将編碼序列導入受體生物中無法轉錄；

（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選标記；

（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；

（5）有時需要确定目的基因表達的産物存在于細胞的什麼部位，往往要加上可以标識存在部位的基因（或做成目的基因與标識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。

2.根據農杆菌可将目的基因導入雙子葉植物的機理，你能分析出農杆菌不能将目的基因導入單子葉植物的原因嗎？若想将一個抗病基因導入單子葉植物，如小麥，從理論上說，你應該如何做？

提示：農杆菌可分為根瘤農杆菌和發根農杆菌，在植物基因工程中以根瘤農杆菌的Ti質粒介導的遺傳轉化最多。根瘤農杆菌廣泛存在于雙子葉植物中。據不完全統計，約有93屬643種雙子葉植物對根瘤農杆菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。當這些植物被該菌侵染後會誘發腫瘤。近年來，也有報道該菌對單子葉植物也有侵染能力。

根瘤農杆菌侵染植物是一個非常複雜的過程。根瘤農杆菌具有趨化性，即植物的受傷組織會産生一些糖類和酚類物質吸引根瘤農杆菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農杆菌侵染的原因。近年來還發現一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導作用。酚類物質和糖類物質既可以作為根瘤農杆菌的趨化物，又可以作為農杆菌中Ti質粒上Vir區（毒性區）基因的誘導物，使Vir區基因活化，導緻T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。

需要注意的是農杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農杆菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農杆菌侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異。

如果想将一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農杆菌，但要注意兩點：①要選擇合适的農杆菌菌株，因為不是所有的農杆菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農杆菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農杆菌的Vir區（誘導）的基因，使T-DNA轉移并插入到染色體DNA上。

3.利用大腸杆菌可以生産出人的胰島素，聯系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生産人的糖蛋白，可以用大腸杆菌嗎？

提示：有些蛋白質肽鍊上有共價結合的糖鍊，這些糖鍊是在内質網和高爾基複合體上加工完成的，内質網和高爾基複合體存在于真核細胞中，大腸杆菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸杆菌中生産這種糖蛋白是不可能的。

4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血症。假如讓你用基因工程的方法，使大腸杆菌生産出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？

提示：基本操作如下：

（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。

（2）将cDNA前接上在大腸杆菌中可以适用的啟動子，另外加上抗四環素的基因，構建成一個表達載體。

（3）将表達載體導入無四環素抗性的大腸杆菌中，然後在含有四環素的培養基上培養大腸杆菌。如果表達載體未進入大腸杆菌中，大腸杆菌會因不含有抗四環素基因而死掉；如果培養基上長出大腸杆菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。

（4）培養進入了β-珠蛋白基因的大腸杆菌，收集菌體，破碎後從中提取β-珠蛋白。

你能推測出由mRNA反轉錄形成cDNA的過程大緻分為哪些步驟嗎？

提示：1970年，特明（H.M. Temin）和巴爾的摩（D. Baltimore）證實了RNA病毒中含有一種能将RNA轉錄成DNA的酶，這種酶被稱為依賴RNA的DNA聚合酶，由于與中心法則中的從DNA到RNA的轉錄是反向的，所以稱為反轉錄酶（reverse transcriptase）。

反轉錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模闆合成與之互補的DNA鍊。像其他DNA聚合酶一樣，反轉錄酶也以5′→3′方向合成DNA（圖1-3）。

圖1-3 由mRNA反轉錄形成cDNA的過程

cDNA合成過程是：第一步，反轉錄酶以RNA為模闆合成一條與RNA互補的DNA單鍊，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鍊降解，使之變成單鍊的DNA。第三步，以單鍊DNA為模闆，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鍊，形成雙鍊DNA分子。

1.為什麼要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體内提取不行嗎？

提示：構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或隻知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體内獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發育的不同階段表達的基因有什麼不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫。

2.将目的基因直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這麼做，結果會怎樣？

提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即将一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法确定什麼基因導入了受體植物。此法目前争議頗多，嚴格來講不算基因工程。

思考與探究

根據所學内容，試概括寫出基因工程解決了哪些生活、生産中難以解決的問題。

提示：基因工程可以生産人類需要的藥物，如胰島素、幹擾素等。我們吃的某些食品如番茄、大豆等也可以是基因工程産品。農業生産中的抗蟲棉、抗病毒煙草、抗除草劑大豆等都已進入商品化生産，上述産品有些是常規方法難以生産的或者生産成本過高。

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