大田作物生産是維持人類生存的重要物質基礎，在植物學上可以分為單子葉和雙子葉作物兩大類，單子葉作物主要包括水稻、小麥和玉米等，雙子葉主要包括大豆、油菜、棉花及番茄、黃瓜等作物。無論是對于單子葉作物還是雙子葉作物，純系創制均是其育種過程的關鍵環節。單倍體育種技術可加速純系選育進程。對于玉米雜交育種來說，選育自交系是其核心環節，常規育種獲得自交系需要8代以上，而DH育種（Doubled Haploid Breeding，國内習慣稱為單倍體育種）隻需要2代，可大大縮短育種年限，因而具有重要意義。單倍體育種技術，轉基因技術和分子标記輔助育種技術是現代育種技術體系的三大核心技術。常識：自交系：在人工控制自花授粉情況下，經若幹代，不斷淘汰不良的穗行，選擇農藝性狀較好的單株進行自交，從而獲得農藝性狀較整齊一緻、遺傳基礎較單純的系，稱為自交系。優良自交系間雜交所産生的生活力強、産量高的雜種後代，稱為自交系間雜交種。其農藝性狀優于品種或品種間雜交種。一般增産20～30%。目前在玉米上應用較多，水稻也有應用。雙單倍體（Doubled Haploid）育種：簡稱DH育種，是利用誘導系誘導（或花藥離體培養等手段誘導）産生單倍體植株，再通過染色體組加倍（自然加倍或藥劑處理）使植物恢複正常染色體數的育種方法。DH育種能夠在較短時間（2代）内便可以選育出DH純系，大大縮短育種年限，是加速種質材料純化、縮短育種年限的有效途徑，是現代生物技術育種的主要支柱技術之一。分子标記輔助育種：分子标記輔助育種是利用分子标記與決定目标性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子标記，即可檢測到目的基因的存在，達到選擇目标性狀的目的，具有快速、準确、不受環境條件幹擾的優點。利用分子标記與決定目标性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子标記，即可檢測到目的基因的存在，達到選擇目标性狀的目的，具有快速、準确、不受環境條件幹擾的優點。可作為鑒别親本親緣關系，回交育種中數量性狀和隐性性狀的轉移、雜種後代的選擇、雜種優勢的預測及品種純度鑒定等各個育種環節的輔助手段。

單倍體（Haploid）指隻具有配子染色體數目的細胞或個體。目前玉米單倍體育種普遍采用孤雌生殖誘導系誘導産生單倍體。單倍體植株一般比較弱小，且表現高度不育，隻有加倍成2倍體才能恢複育性從而獲得種子，加倍後形成的系稱為DH系，DH系表現一緻，可直接用于育種。單倍體育種技術是一項系統化、規模化與工程化的技術，涉及很多技術環節。單倍體的産生是單倍體技術中的核心環節，體外單倍體誘導方法包括花藥培養、小孢子胚胎發生等，但成本高，且勞動強度大。在體内的技術包括種間雜交、花粉的強烈照射和孤雌生殖，但僅限于特定的作物品種。以種子為基礎的體内單倍體誘導方法具有勞動強度低，成本相對較低的特點。緊接着，單倍體再通過秋水仙素加倍獲得純系，但秋水仙堿的毒性較大且加倍時間不好控制、加倍效率也不敢保證。

近年來，以生物誘導為基礎的單倍體育種技術已逐步成為玉米育種的關鍵性技術。自1959年美國遺傳學家E. H. Coe, Jr報道的Stock6作為父本誘導系可以誘導母本單倍體以來（誘導率僅為1-2%），但由于Stock6的一些缺點，諸如誘導率低，散粉性不好，自交結實性較差、保存種子困難；過去幾十年，由Stock6衍生的一系列誘導系已成為DH育種的最有效的方法，雖然也有一些關于誘導率定位研究的報道，但控制誘導率的基因仍不清楚。

2017年，首次克隆了一個控制玉米單倍體誘導基因MTL/PLA1直到2017年1月23日，Nature雜志上發表來自先正達公司Timothy Kelliher等題為“MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction”研究論文。該文在玉米中第一次克隆了一個控制玉米單倍體誘導基因（基因命名為MTL，特異性在玉米精細胞中表達的磷脂酶），研究表明誘導系與玉米非誘導系B73相比，誘導系中的誘導基因第四外顯子處有4bp插入（CGAG），導緻了20個氨基酸的移碼突變，導緻誘導系具有誘導單倍體的作用。同時發現該基因具有高度保守性。

花粉特異性磷脂酶基因突變誘導的單倍體玉米（來源：先正達Nature）與此同時，2017年2月4日，中國科學家（中國農大的陳紹江教授、金危危教授及華中農大的嚴建兵教授團隊）聯合在Molecular Plant上同樣也報道了該誘導基因（基因命名為ZMPLA1）。中國科學家發現該4bp插入隻存在于玉米誘導系中，在玉米祖先（大刍草）及玉米非誘導系中均檢測不到；兩個研究不同的是對基因功能的驗證，先正達公司使用的是互補實驗及TALEN基因編輯技術；而中國科學家使用的是CRISPER/Cas9基因編輯技術，随後用T1代轉基因材料與國内知名玉米雜交種鄭單956和京科968雜交來測驗T1代轉基因材料的誘導率。

圖. ZMPLA1基因的4bp的插入突變導緻誘導系誘導單倍體（Molecular Plant,2017）鑒于該基因在作物中的保守性，因此也可在其他作物中通過修飾該基因實現DH育種。其它作物，如水稻中，還沒有利用單倍體誘導來進行育種的報道。該基因的克隆有望讓更多的作物進行單倍體育種，從而加快育種進程。

2019年，首個非Stock6來源的玉米單倍體誘導另一個關鍵誘導基因ZmDMP被克隆兩年後，2019年，玉米單倍體育種技術研究中再次迎來了新突破。中國農大的陳紹江教授團隊曆經10餘年不懈努力，在國際上率先克隆了首個非Stock6來源的玉米單倍體誘導另一個關鍵基因ZmDMP，這是該團隊繼克隆關鍵誘導基因ZmPLA1後取得的又一重大進展，這一關鍵基因的克隆為理解單倍體高頻誘導的成因奠定了堅實的理論基礎。

該課題組利用其選育的兩個誘導率不同的誘導系CAUHOI和CAU5組配的群體進行圖位克隆。先後從2萬多個F2單株中篩選出37個交換單株，以基因分型子代測驗的方法，将qhir8的候選基因區間縮小至318 bp，鎖定了編碼DUF679結構域膜蛋白（DUF679 domain membrane protein）的基因ZmDMP及其功能位點。該基因編碼205個氨基酸，研究團隊利用基因編輯等方法驗證了該基因就是單倍體誘導的關鍵貢獻基因。研究結果表明，在ZmPLA1突變的基礎上，ZmDMP起始密碼子下遊的第131bp上T到C的單堿基替換導緻氨基酸的錯義突變，進而将單倍體誘導率提高2~3倍。将ZmDMP完全敲除則可進一步将單倍體誘導率提高5~6倍，呈現出顯著的倍增效應。非常值得關注的是，該研究還發現了ZmDMP基因敲除後具有獨立的誘導單倍體能力，這是首次在非stock6材料上發現獨立誘導現象。通過ZmDMP的表達模式和亞細胞定位分析發現，該基因與ZmPLA1具有一定的相似性，均在成熟的花粉中表達和定位在細胞膜上。表明ZmDMP與ZmPLA1有可能在單倍體誘導的過程中參與相同的通路。同時，通過基因序列比較分析，發現該基因在大部分雙子葉植物中具有較高保守性，因此在功能上可能具有保守性。

利用上述發現的控制玉米單倍體誘導基因MTL/ZMPLA1和ZmDMP在各物種的保守性，在單子葉植物，如水稻、小麥中和雙子葉植物，如拟南芥中也實現了高效率的單倍體誘導作用。：

水稻中單倍體誘導基因OsMATL2018年7月10日，來自先正達的研究團隊在Nature Plants發表了一篇題為“OsMATL mutation induces haploid seed formation in indica rice”的論文。該研究發現水稻中的玉米MTL同源基因OsMATL突變後可以誘導單倍體種子的形成。該研究利用CRISPR-Cas9技術突變OsMATL基因。結果發現，OsMATL突變後平均單倍體誘導率（haploid induction rate，HIR）為6%左右，授粉後種子結實率為20%，與玉米中MTL突變後的結果基本一緻。據悉，先正達公司在2016年11月18日已就本研究相關的基因和技術提交了專利申請。

2019年7月25日，Plant Biotechnology Journal在線發表了中國農業大學陳紹江教授團隊的研究論文“Extension of the in vivo haploid induction system from diploid maize to hexaploid wheat”。該團隊在克隆玉米單倍體關鍵誘導基因ZmPLA1的基礎上，以異源六倍體小麥為模式開展了單倍體誘導能力驗證研究。單倍體誘導基因在小麥中存在3個同源基因，分别位于A、B和D基因組上。利用CRISPR對第一外顯子進行編輯，成功獲得了小麥A、D基因組的磷脂酶基因TaPLA的突變體。實驗數據表明，該突變體在自交或與中國春等母本材料雜交後代中可誘導産生約5%-15%的單倍體，其頻率較玉米ZmPLA1單基因突變體高。同時，小麥突變體在自交和雜交過程中還伴随大量的敗育籽粒和一定頻率的非整倍體籽粒。進一步對TaPLAs進行亞細胞定位分析發現其編碼的蛋白均定位于細胞膜上，且TaPLAs突變後對花粉粒發育并沒有影響。這與玉米中的單倍體誘導基因ZmPLA1結果類似，表明單倍體産生在不同倍性作物中可能具有相似的機制。該研究在實踐上不僅可為在小麥等多倍體作物上建立新型單倍體育種系統提供重要參考，而且還可能進一步與基因編輯和染色體工程等技術結合，開辟快速定向改良新途徑。至此，以誘導基因為基礎的母本單倍體誘導系統在三大糧食作物上均已獲得驗證，未來有望成為主要農作物純系創制與性狀快速改良的共性關鍵技術。單子葉植物到雙子葉植物的單倍體誘導技術突破雙子葉主要包括大豆、油菜、棉花及番茄、黃瓜等作物。無論是對于單子葉作物還是雙子葉作物，純系創制均是其育種過程的關鍵環節。2019年5月15日，陳紹江教授團隊在Nature Plants期刊發表了以“A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonous Arabidopsis” 為題研究論文。對拟南芥中的ZmDMP同源基因進行敲除，成功獲得了拟南芥的單倍體，為建立雙子葉作物單倍體育種技術體系奠定了基礎。陳紹江教授團隊在玉米單倍體育種技術的拓展應用上再次取得突破性進展。研究團隊通過對基因序列比對分析，發現玉米單倍體誘導基因ZmDMP在雙子葉植物中的保守性較高。為驗證其在雙子葉植物上的功能，研究團隊對拟南芥中的ZmDMP同源基因進行敲除，成功獲得了拟南芥的單倍體。該研究首次将玉米孤雌生殖單倍體的誘導方法拓展至雙子葉植物拟南芥中，并建立了基于熒光的拟南芥單倍體籽粒鑒别方法，為建立雙子葉作物單倍體育種技術體系奠定了基礎。

陳紹江教授團隊榮獲2019年國家技術發明獎一等獎

國家技術發明獎一等獎

提名項目：玉米單倍體高效育種技術體系創建及應用

提名單位：教育部

第一完成人：陳紹江 教授，中國農業大學

單倍體育種技術是玉米育種的革命性技術。該項目研究團隊曆經長期系統研究，在單倍體育種的基礎理論及關鍵技術領域均取得了原創性的重要突破，解決了玉米育種選系周期長這一共性核心技術瓶頸，大大加快了育種進程。項目的主要發明創新點有：精細定位并克隆了單倍體誘導的關鍵基因；建立了誘導系的分子育種技術，首創高油型誘導系，育成系列高頻誘導系；提出了油分鑒别單倍體新的技術原理并成功研發出自動化單倍體鑒别篩選設備；創建了單倍體高效加倍技術。通過對上述關鍵技術的集成，構建了玉米單倍體高效育種技術體系，形成新的育種模式，利用該技術創制新品種已經大面積推廣。 該項目通過建立全國玉米單倍體育種技術協作組等形式，有力地促進了該技術在國内科研單位和種子企業的廣泛應用，推動了我國玉米育種技術的轉型與升級。項目成果的原創性強，對國内外玉米單倍體育種理論和技術發展均起到了重要的引領作用。該成果将技術發明與應用基礎研究和育種實踐緊密結合，創建了單倍體育種的高效技術體系，具有重大的科學意義和應用價值。

項目簡介

近十年來，着絲粒組蛋白CENH3也成為單倍體誘導的研究熱點。而且所有真核生物都表達多種H3變體，通過修飾着絲粒特異性組蛋白H3變體CENH3來誘導單倍體已經在拟南芥中被證明。突變CENH3基因并創造非轉基因單倍體誘導系2020年2月24日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發表了美國加州大學戴維斯分校研究團隊題為 "A variety of changes, including CRISPR/Cas9 mediated deletions, in CENH3 lead to haploid induction on outcrossing " 的研究論文。

在該研究中，作者在拟南芥中鑒定了另外31個CENH3，它們在植物中都是高度保守，并有能力執行CENH3參與的有絲分裂和減數分裂活動。EMS誘變系的氨基酸突變形式可以通過野生型授粉後互補内源cenh3突變基因型并誘導單倍體後代的産生。同時研究者還測試了通過兩輪EMS誘變所産生的雙氨基酸位點突變的效果。最後研究者意外發現利用CRISPR/Cas9技術誘導保守的CENH3組蛋白折疊機構域中αN螺旋的移碼突變，能夠獲得優良的單倍體誘導系，并且在用野生型花粉授粉時生長和發育均表現正常。該研究結果展示出了EMS和CRISPR/Cas9突變CENH3基因并創造非轉基因單倍體誘導系的前景。這些發現為作物育種者培育單倍體誘導劑提供了更多的選擇。

CRISPR/Cas9介導的CENH3突變體的産生RNAi消減CENH3基因揭示誘發假雄配子的劑量效應2020年6月17日，山東農業大學作物生物學國家重點實驗室曾範昌課題組，在iScience在線發表了題為“Haploid bio-induction in plant through mock sexual reproduction”的最新研究進展。該研究針對消減染色體的經典着絲粒組蛋白基因CenH3，在篩選系列相關化學抑制劑及體外誘導效應的基礎上，結合基因幹涉操作技術，從體内和體外鑒定了植物兩性花有性生殖過程中伴随的誘發假雄配子的劑量效應，并提出并驗證了假受精介導的虛拟有性生殖，誘發孤雌單性生殖和種子單倍體形成這一科學假設和全新理論。

實例一：2019年3月，先正達的研發團隊（Timothy Kelliher 和Qiudeng Que共同通訊作者）利用能誘導産生單倍體株系的玉米花粉作為基因編輯的載體來通過授粉給有重要商業價值的品系，對商業化品種進行直接的基因組修飾，從而達到快速精準地實現玉米改良的目的。這是一個非常精妙的構思和科研創新，因為花粉中攜帶CRISPR裝置的雄性基因組在受精後不久就會消失，新産生的植株含有部分母本的染色體，使之能快速創制穩定的育種所需要的變異材料（詳見下圖）。這是一種加快育種進程的新策略。有專家評論說：“通過結合兩種技術：單倍體誘導和基因組編輯，它具有想象力。”

利用HI-Edit策略獲得理想DH系的流程圖由于來自誘導産生單倍體株系的父本花粉中含有基因編輯的複合體，在受精過程中将消失掉，産生的後代中并沒有外源的基因，和轉基因技術含有外源插入的基因不一樣，在美國可以規避複雜的法規審批需求。實例二：2020年7月中國農業科學院謝傳曉研究員發表論文，利用基因編輯技術一步創制雄性不育系和保持系，為作物雜交技術提供了高效的培育方案。在這項研究中，利用CRISPR/Cas9的新系統簡化了雜交育種的流程，僅需一步就可以創制不育系和保持系，并同時解決了不育基因導入和不育株篩選的問題。如圖所示，謝曉傳研究團隊構建了兩個載體：一個用來構建創制雄性不育系，用來創制保持系。MS26ΔE5-Editor 載體具有基因編輯活性，用于創制雄性不育系。通過剪掉玉米中育性基因MS26的一小段，使MS26基因失去功能，讓玉米雄性不育。而MGM載體則用于創制保持系，包括三個基因，一個用來恢複MS26的功能，另一個是能導緻花粉失去活性的酶，還有一個會讓玉米粒發出紅色熒光。最終，經過處理的玉米胚胎将攜帶兩個被剪切的MS26和一個MGM拷貝。

在雜交體系中，使用不育系作為母本，就可以與其他父本優勢種雜交獲得雜交種。而使用保持系自交時，由于MGM上攜帶的花粉澱粉酶基因會造成花粉敗育，因此隻有不攜帶MGM的花粉可以作為雄配子，雌配子則一半攜帶MGM，一半不攜帶MGM，最終産生一半不育系和一半保持系。由于MGM上的熒光基因，保持系的玉米籽粒會發出熒光。實驗證明，不管是人工和機器方法都可以有效的區分不育系和保持系籽粒的熒光，以便篩選。在這個系統中，不育系植株不攜帶外源性的MGM基因，因此隻要是與非轉基因品種雜交産生的後代，就不含外源基因。目前，單倍體育種技術已經在國内外多家企業應用實現轉型，在國家和省級農科大學及研究院所廣泛使用，跨國企業規模化應用。

綜上， 單倍體育種技術具有操作相對簡便、育種周期短（隻需要2代）、效率高等優點，在育種中的應用前景十分廣闊。單倍體育種技術已經成為代育種技術體系的三大核心技術之一。随着其關鍵調控基因的進一步挖掘和基因編輯技術的深度耦合并形成技術體系，實行工廠化育種指日可待。未來，單倍體育種必将引領新一輪的育種技術革命！！！

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