近十多年來藥物質量的重點已悄然地從“含量”轉移到“有關物質”的研究，各種分析技術百花齊放，相争鬥豔。但是就有關物質的分離和研究，尚無哪一門分離技術能取代高效液相色譜。

目前液相色譜的理論和技術在國内藥物研發方面的應用還處于較低水平，主要表現在：建立創新藥有關物質方法中所表現的“trial and error”思維模式；仿藥雜質研究中機械地套用現成的藥典方法來完成任務。無論是出現這兩種形式中的任何問題，我們的分析人員都會束手無策。既看不到問題出現的原因，更找不到解決問題的思路和方法。

實際上現代液相色譜分離的技術不僅理論上突飛猛進，而且各種儀器設備和色譜柱填料也是日新月異。那麼為什麼這些科學技術進步在制藥研發工業界引起的反響卻遠遠不夠呢？我認為主要存在以下原因：分析人員的色譜理論知識的匮乏；現代液相色譜理論的複雜性，就反相色譜而言，大部分物質都是“不規則樣品”，無論是傳統的“Hydrophobic Interaction”、“Distribution”、還是“Adsorption”理論，都無法單獨解釋液相色譜的保留和分離行為；填料供應商目前尚不能做到站在研發者的角度上分析問題，研發者就難以從項目特點出發來選擇适合的色譜柱和色譜條件。

圖1 缬沙坦的logD預測曲線（用ACD/Percepta logD預測模塊）

圖1中，缬沙坦在低pH情況下，化合物為分子态，疏水性高，反相色譜的保留強。在pH3到6之間，其疏水性變動很快，到了高pH值範圍，酸性基團都電離化，分子極性增加，疏水性低。通過深入了解這條曲線，我們能夠通過調控pH控制缬沙坦的出峰。

logD的範圍和色譜柱的性能是應當有所匹配的。如果在某個pH下，化合物logD數值大于5，再選用保留能力特别強的柱子，肯定洗脫時間要很長，降低方法的質量；如果化合物logD數值小于-3，再用保留能力特别弱的反相柱，那此目标物一定超快被洗脫，方法的質量也不好。

其次，pKa對于色譜方法開發工作來說也是非常重要的理化參數，上文其實已經提到了很多。但是有人會把它與路易斯酸的定義混淆，也有人在看到一個化合物有多個pKa時無法判斷哪些是酸性pKa哪些是堿性pKa，從而對适宜pH範圍的選擇無法判斷。酸堿化合物的pKa計算公式如下：

圖2 普萘洛爾的pKa預測（用ACD/Percepta pKa預測模塊）

圖2中，普萘洛爾醇羟基的pKa值為~13.9，顯弱酸性，意味着在極強強堿中它才會脫去H ，帶上負電荷。而結構中的仲胺pKa值為~9.5，為常規脂肪胺，在pH 0到8的範圍内基本都是解離狀态（BH ），帶一個單位的正電荷，到了pH9.5左右，溶液中一半為離子狀态一半為分子狀态。上圖中紅色部分帶正電荷為離子狀态，白色部分不帶電荷為遊離态，藍色部分帶負電荷。根據“pH值±2”原則，如果普萘洛爾是方法開發中最重要的因素，選pH值時要要規避其pKa範圍以确保其出峰的穩定性，在本例中勢必要在酸性環境下進行堿性化合物的分離了。拓展來說，在pKa±1的範圍内，調節pH，能夠很好的控制樣品的保留時間和選擇性，可以因此而解決分離度的問題。

總的來說，logD可以認為是結合了pKa和logP特點的綜合性參數，理解和掌握這個參數對反相色譜方法開發的研究非常重要。理解logD，再結合下文提到的疏水減法模型，将幫助分析人員進一步理解液相色譜分離的本質。

在色譜方法開發工作的前期調研階段，可以考慮将所有已知結構物質的logD曲線繪制在一張圖上來近似了解和選擇适宜的pH範圍。如下圖3，藥物分子的logD曲線的堆疊圖。

圖3 多個藥物分子的logD曲線堆疊圖

第二部分 理解色譜柱的選擇性

色譜柱的選擇性差異是溶質分子被分離的重要前提，而色譜柱選擇性的量化和統一，則有賴于施耐德等人提出的疏水減法模型（hydrophobic-subtraction model）。

這個模型的表達式是logɑ=log(k/kEB)=Ƞ’H-δ’S β’A ɑ’B κ’C。

這個方程式總結了RPC保留機制和色譜柱選擇性的理解。模型的左側表征溶質分子的保留情況，kEB表示隻有疏水相互作用的乙苯的保留。右側的各項分别表征疏水相互作用（Ƞ’H項），分子的形狀大小因素（δ’S項），相互間的氫鍵作用（β’A ɑ’B項），相互間的離子交換作用（κ’C項）。每一項希臘字母代表的是溶質分子，每一項的英文字母代表的是色譜柱的能力。

同時可以得到，任意兩根色譜柱的選擇性比較公式如下：

如果Fs<3,兩根柱子具有相似的性質（選擇度α相近)，Fs值越大，兩根柱子具有不同的性質（選擇度α不同）。色譜柱的A，B，C由矽醇基和鍵合相來體現。不同pH值條件下，矽醇基的暴露量以及其電離情況也在動态變動。

通過這個疏水減法模型，設計和使用一定的标準物質，可以将常用的色譜柱進行量化，隻有進行量化，才有可能進行比較和選擇。這樣的選擇是有目标的，理性的，而不是随機的。

Euerby和Peterson在2003年的“Journal of Chromatography A”上發表了這個模型的應用，對市面上常見的色譜柱進行TANAKA柱效實驗的測定，實現了對色譜柱選擇性的量化。類似的工作還在繼續，最新版數據庫的色譜柱數量已超過了300根，其工作成果已經在ACD/Labs網站上的freeware上免費提供，名稱為“column selector”，用戶可以直接進行色譜柱比較。在各項能力上接近的色譜柱，被認為選擇性比較接近。下圖4則是在最新版ACD軟件中固化的功能。

圖4 ACD/ Column Compare的界面

前述經驗公式的“H”相為上圖中的“aCH2”，“S”相為“aT/O”，“A、B”相為“aC/P”，”“C”相為“aB/P”。舉例來說，圖中Luna C18和Zorbax SB-C18在粒徑，密度方面區别較大，但是在實際應用中其疏水選擇性和立體選擇性接近。如果用于分析中性化合物，這兩根色譜柱是可以替換的。如果用于在酸性環境下（例如pH3）分析離子型化合物，也是可以替換的。在中性，弱堿性環境下（例如pH7）, Zorbax SB-C18的離子交換能力遠大于Luna C18，會增大離子化溶質的保留，比如結構中具有帶正電荷的基團，二者的可替換性就變差了。

與第一節的内容互相呼應，logD的數據可以認為是Ƞ’H中的Ƞ’，而對pKa的理解我們可以掌握在當前pH下溶質的離子化狀态，了解其發生離子交換能力的可能性，再加上對結構本身氫鍵供體和受體的認知，我們拿這些知識來解決一些問題，應該說會有很好的理論支持。

第三部分 分析方法模型化和方法預篩選

疏水減法模型本身是一個等式，意味着有可能對一個方法建立一個方程式，這個方程式可以用來解釋溶質在這個方法下的的保留。運用統計學對建立的保留時間預測方程式進行多元回歸。

圖5 ACD色譜數據庫中的方法

通過計算“圖5”中色譜方法收集到的化合物特性，例如疏水性logD，分子體積、極性表面積、氫鍵供體和受體數目，對相對保留時間建立方程式進行多元回歸，見表1。

表1 四個樣本建立的方程式列表

表1中的方程式說明當前方法物質的保留時間僅和化合物的疏水性logD成正比。這樣的方程式用于預測集接近的化合物保留時間具有一定意義，但是樣本量偏少。但如果将一個常用方法，給它多樣性的分子，再去建立統計學模型，更具有實用性，可以用來進行方法的預篩選。下圖6是用180個樣本分子在10個方法基礎上建立的保留時間統計學模型，然後對5個目标分子進行保留時間和分離情況的預測。

圖6 用ACD/ChromGenius做方法預篩選

圖6的預測結果顯示，至少有4個方法能夠對這5個分子有很好的分離。

第四部分 液相色譜模拟技術的應用

液相色譜的模拟技術并不是一個新穎的詞彙，實際上它已經出現了超過20年。用數學方程式來拟合物質在色譜柱内的運動情況是一個成熟的技術，也發表了很多文獻。不過在國内，能夠熟練掌握色譜模拟軟件的人還是很少。應用模拟技術，可以解決trial & error模式研究策略的弊端，可實現在短時間内使分離最優化。

有人總結過當以下一個或多個條件适用時，推薦使用計算機模拟技術，這樣它的價值可能會實現最大化：

1. 梯度洗脫研究

2. 包含5-10種甚至更多組分的複雜樣品

3. 方法的耐用性非常重要

4. 微小的分離度或分離時間的改善都很有意義

5. 期望快速解決分離度問題

6. 從分子結構預測溶質的保留和pKa

7. 根據相同或不同的選擇性選擇反相色譜柱

隻含有幾種成分樣品的分離，時間不是問題的情況下使用模拟軟件是沒有優勢的。以下舉一個用少數幾針進樣，通過模拟軟件解決問題的例子：

案例的背景是一個中藥指紋圖譜的分析方法在夏季和冬季時産生了很大的差異，圖7的上半部分為夏季檢測結果，下半部分為冬季檢測結果。可以看出，在冬季時某個物質(夏季圖中RT=48.49min)保留明顯增加，此物質與其後的物質（夏季圖中RT=50.84min）發生共流。

圖8 35℃、25℃和45℃時的色譜圖

根據以上三個溫度的保留情況建立模型，目标物質分離度在2.0以上的溫度範圍為：32.5~38.5℃，如圖9所示。在冬季，企業發現共流時，模型顯示其色譜柱内的實際溫度大約為29℃。估計其根本原因是柱溫箱的控溫能力在不同環境溫度下差異較大導緻。

圖9 ACD/LC simulator建模後的邊界和邊界條件下的模拟情況

上述案例從色譜理論上可以用Van’t Hoffequation 方程來解釋，公式如下：

用Log k vs. 1/Tk作圖得線性關系圖，其中：K為保留因子，Tk為溫度（凱爾文），A為截距（常數），B為斜率（常數）。

兩個化合物的k值相比得到：α=ki/kj

同樣可以得到：log α = a b/Tk，

用Log α vs. 1/Tk作圖得線性關系圖，其中：α為分離因子，Tk為溫度（凱爾文），a為截距（常數），b為斜率（常數）。

假設上述夏季圖譜中的RT=48.49min為k1，RT=50.84min為k2，α=k1/k2，得到Log α vs. Tk作圖，見圖10.

圖10 Log α vs. 1000/Tk的線性圖

從圖10中可以看出，當 log α=0時，k1=k2，即兩個化合物發生共流，當 log α<0或log α>0時，兩個化合物的洗脫順序相反，均能達到分離。另外，溫度的變化對手性化合物的分離也有很好的選擇性作用。

液相色譜模拟技術的問題是它需要色譜工作者花時間學習。但應用它往往可以降低成本（人力，時間，物料）并提高最終方法的質量，對于經驗豐富的開發者一樣具有意義。從另一個方面來說，模拟技術不是色譜技能的替代者，色譜工作者的知識和技能是有效使用模拟軟件的基礎。

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