包埋法酶的固定化技術?摘要：氟固相萃取(fluoroussolid-phaseextraction,FSPE)是一項基于氟-氟相互作用的固相萃取技術，它依靠高氟化目标化合物和高氟化固定相之間的親和力，将目标化合物保留在固定相上，然後通過親氟試劑将目标化合物洗脫下來，實現對目标化合物的分離和純化近年來，FSPE被廣泛應用于多肽的富集和純化但由于多肽中一般不含有高氟化官能團，所以在多肽分子上連接此類高氟化的标簽成為了FSPE應用于多肽純化的關鍵本文對氟親和标簽引入多肽的方式、種類以及其在多肽合成、純化和富集中的應用和相關技術進行總結和闡述，接下來我們就來聊聊關于包埋法酶的固定化技術?以下内容大家不妨參考一二希望能幫到您!

包埋法酶的固定化技術

摘要：氟固相萃取(fluoroussolid-phaseextraction,FSPE)是一項基于氟-氟相互作用的固相萃取技術，它依靠高氟化目标化合物和高氟化固定相之間的親和力，将目标化合物保留在固定相上，然後通過親氟試劑将目标化合物洗脫下來，實現對目标化合物的分離和純化。近年來，FSPE被廣泛應用于多肽的富集和純化。但由于多肽中一般不含有高氟化官能團，所以在多肽分子上連接此類高氟化的标簽成為了FSPE應用于多肽純化的關鍵。本文對氟親和标簽引入多肽的方式、種類以及其在多肽合成、純化和富集中的應用和相關技術進行總結和闡述。

關鍵詞： 多肽純化 多肽藥物 氟固相萃取 氟标簽 離子化效率

随着多肽合成技術的發展，越來越多的多肽藥物出現在了市場上。相對于絕大部分傳統小分子藥物來說，多肽藥物具有活性高、毒性低、選擇性高等優勢[1,2]，吸引了許多藥物科學家的關注。但是多肽類藥物具有易降解、在血漿中不穩定、基質幹擾大、離子化效率低等缺點，給多肽分析造成了巨大困難。

目前多肽的化學合成主要依靠固相合成方法，這種方法操作較為簡單，但是随着肽鍊的延長，副産物在樹脂上逐步積聚，導緻目标多肽純度顯著降低，給終産物的分離和純化帶來巨大的困難。為了有效地純化多肽，超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、HPLC[3,4]等方法被相繼開發出來。但是這些分離純化的方法大多都是基于多肽的分子量大小、等電點、極性大小等性質來實現多肽和其他雜質的分離，選擇性不高，尤其當目标多肽和雜質性質相似時(比如隻比目标多肽短了一個氨基酸殘基的序列)，這些方法的純化效率就會大大降低。

利用親和力進行純化的方法具有很高的選擇性，例如固定化金屬親和層析法純化磷酸化多肽[5]、凝集素與糖蛋白結合進行細胞識别和黏着[6]、利用鎳柱中的氯化鎳與含6個組氨酸标簽(His6)的蛋白之間的親和力來純化帶His6标簽的蛋白[7]、生物素親和層析法提純鍊黴親和素等。但是這些傳統的親和力方法具有明顯的局限性，比如會出現目标分子洗脫不完全、回收率低、使質譜譜圖複雜化、親和力方法所用試劑對價格昂貴等問題。近年來，一種基于氟親和力的分析方法——氟親和技術逐漸發展起來，該方法已被用于催化劑的回收和再利用[8]、反應中間體的去除、平行合成産物的共純化以及各種基質中全氟化合物的檢測和去除[9,10,11,12]等，基于此技術，最近有科學家還合成了氟化探針，用于識别和分離生物蛋白[13]。含有全氟烷烴鍊的物質具有高電負性、低極性、高熱穩定性[14]、高化學穩定性以及強疏水性[15]和疏油性[16]等性質，由于其強疏水性，引入含全氟烷烴鍊殘基的抗菌肽呈現出更強的抗菌活性[17]。此類物質與水和不含氟的有機溶劑均不互溶，但是彼此間卻有良好的互溶性，這是因為氟原子之間存在一種專屬的相互作用力，稱之為“氟親和力”。也正是因為這種隻有氟原子間才具有的非共價相互作用，使得氟親和技術具有高度的選擇性。目前基于氟親和原理的含氟固定相液相色譜和氟固相萃取(fluoroussolid-phaseextraction,FSPE)[18]被認為是複雜基質中分離純化目标化合物最具潛力的方法之一。

将FSPE引入多肽合成能極大簡化多肽的純化過程，引入氟标簽的思路，大緻分為2種：第1種是将氟标簽連至反應終産物上，最後通過FSPE純化以及除去氟标簽得到目标産物；第2種是将氟标簽試劑作為封端劑，使氟标簽與未反應完全的裸露氨基連接，防止雜質參與後續的肽鍊增長反應，最後僅通過FSPE純化即可得到目标産物，可省去去除氟标簽的步驟[19]，這2種思路各有利弊，第1種更加直觀，第2種則可簡化純化步驟。

要将FSPE運用于多肽純化，必須在多肽鍊上引入一個氟标簽。氟标簽由全氟烷烴鍊和連接臂兩部分組成，全氟烷烴鍊是将普通烷烴鍊中所有氫原子用氟原子取代而成的基團[20]，連接臂通常由若幹個亞甲基構成，目的是将全氟烷烴鍊對修飾過後分子的反應活性的影響降至最低。氟标簽的引入會顯著增加衍生化肽或蛋白分子的大小，并可能在接下來的串聯質譜分析中進一步使其譜圖複雜化。為避免此問題，在LC-MS分析之前，将全氟烷烴鍊和連接臂切除，會對接下來的分析有極大幫助。本文分别就基于FSPE原理的相關技術、氟标簽的種類以及FSPE富集特殊肽的應用進行總結和闡述。

1、基于FSPE原理的相關技術

1.1标準FSPE

FSPE的基本步驟是先将含高氟化目标分析物的混合物上樣至高氟化固定相[此處的“高氟化”，是指将烷烴基團中相應數量的氫原子(通常為7～20)替換為氟原子[21]，目前使用的高氟化固定相一般為鍵合全氟烷烴鍊的矽膠]，利用氟親和力将高氟化物質保留在固定相上，然後再用疏氟溶劑(如甲醇水溶液)洗去雜質、用親氟溶劑(如甲醇、乙腈、四氫呋喃)洗脫目标分析物[22]，實現對目标分析物的分離和純化。由于FSPE的洗脫條件是高濃度有機相或純有機相，與樣品進質譜前的除鹽過程十分匹配[23,24]；且氟标簽自身的疏水性和穩定性能提高含氟标簽化合物的質譜響應和其碎片離子的穩定性。所以氟标簽的引入十分有利于後續的質譜分析，再加上其操作簡便，純化過程耗時短且高效，受到了化學家的廣泛青睐。

1.2反向FSPE

“反向FSPE”就是和“标準FSPE”相反，通過将親氟固定相變為極性固定相、疏氟洗滌液變為親氟溶劑，首先從色譜柱上洗下含氟标簽的化合物，同時保留其餘物質。Matsugi等[25]将反向FSPE運用于異哌啶酸的酰胺偶聯反應中，異哌啶酸分别與含C4F9、C6F13、C8F17的試劑偶聯，生成的産物都能通過反向FSPE得到很好的分離。值得注意的是，含C4F9的物質由于含氟量較低，在标準FSPE中很難得到理想的分離效果，但是在反向FSPE中分離效果良好。另外，與标準FSPE相比，反向FSPE的優勢在于該技術使用廉價的矽膠作為固定相以及能夠被常規回收和再循環利用的含氟溶劑作為洗脫液，且當含氟化合物是待純化的目标分析物時，由于其會首先流出，此時該方法會比标準FSPE更加快捷。

1.3氟矽烷化多孔矽表面的激光解吸離子化質譜

多孔矽表面的解吸離子化質譜(desorption/ionizationonporoussiliconmassspectrometry,DIOS-MS)是由Buriak等于1999年提出的一種新的生物質譜分析方法，即利用多孔矽的特殊結構來吸收和傳遞能量，在分析樣品時不需要加入基體[26]，隻需将樣品直接點在多孔矽表面即可，消除了基體引入的背景幹擾。近年來，報道了用适當的疏水性矽烷對氧化的多孔矽進行表面修飾[27]，能使分析物通過疏水相互作用吸收到表面，從而直接從複雜的基質中提取分析物。

2007年，Go等[28]用氟化試劑來修飾存在于臭氧氧化的多孔矽表面的羟基，生成了全氟烷基化的多孔矽DIOS表面，在用高比例有機溶劑洗去不含氟物質之後，直接進行DIOS-MS分析。結果表明，這種基于氟親和力的DIOS-MS方法能夠實現含氟标簽小分子、多肽以及蛋白質的選擇性富集和分析。

2、氟标簽種類

氨基和羧基這2個官能團是氨基酸的主要特征基團，所以在諸多氨基酸保護基中，針對氨基和羧基的保護基的研究尤為透徹。

2.1與氨基相連的氟标簽

2001年，Luo等[29]成功地合成了一系列類似于叔丁氧羰基的氟化基團——氟化叔丁氧羰基，并且成功将此類試劑應用于氨基酸的氨基保護基，結構見圖1。此類衍生化試劑是由氟标簽取代甲基上的氫原子衍生化而成。實驗表明，當連接臂由3個亞甲基組成時，具有更好的分離效果。

圖1氟化叔丁氧羰基的結構

2002年，Filippov等[30]以苄氧羰基氯(benzyloxycarbonylchloride,Z-Cl)為模闆，在其苯環對位的位置取代上氟标簽，合成了氟化苄氧羰基氯(fluorousbenzyloxycarbonylchloride,FZ-Cl)；在FZ-Cl的鄰位連上甲基，合成了FMZ-Cl；在FZ-Cl的結構基礎上，将亞乙基連接臂替換為亞乙烯基，合成了FEZ-Cl(FZ-Cl、FMZ-Cl、FEZ-Cl的結構見圖2)。苄氧羰基類保護基是酸不穩定性保護基，根據脫除保護基所需條件的不同，确定對酸穩定性順序為FEZ>Z>FZ>FMZ。

圖2FZ-Cl、FMZ-Cl和FEZ-Cl的結構

2003年，Curran等[31]合成了另一類苄氧羰基類的氟化試劑——氟化苄氧羰基羟基琥珀酰亞胺酯，結構見圖3。與Filippov等所合成的氟化試劑不同的是，Curran等将羰基氯的結構替換成了琥珀酰亞胺酯的結構，作為一個更容易發生取代反應的離去基團。Curran等用此類氟化試劑對20個天然氨基酸中的18個(精氨酸和組氨酸未成功)進行了衍生化，結果顯示，衍生化産物擁有極好的純度和産量。引入這些氟化氨基酸合成的多肽，可以順利通過氟親和色譜法實現簡便有效的純化。Curran等還對氟标簽中全氟烷烴鍊的長度進行了考察，結果顯示，C6F13在含氟填料上的保留時間較C8F17更短，所以C8F17成為了氟标簽的首選。

圖3氟化苄氧羰基羟基琥珀酰亞胺酯的結構

2003年，Visser等[32]将保護基甲基磺酰基乙氧基羰基的甲基部分替換為8個碳的氟标簽，合成了新型氟化試劑——氟化甲基磺酰基乙氧基羰基氯，結構見圖4。用含氟固定相液相色譜法和FSPE純化所得的FMsc-多肽均有很高的純度。值得注意的是，FMsc和Msc都是堿不穩定的保護基，例如FMsc能在2%氨水溶液中完全脫除，Msc能在二惡烷-甲醇氫氧化鈉混合物中完全脫除。這使得FMsc和Msc能用于含Boc、tBu等酸不穩定性保護基的多肽的合成。

圖4氟化甲基磺酰基乙氧基羰基氯的結構

2006年，Manzoni等[33]将三氯乙氧基羰基氯的3個氯原子全部去除，換上8碳的全氟烷烴鍊，然後在臨近的亞甲基上連上1個溴原子，合成了新的氟化試劑——氟化乙氧基羰基氯，結構見圖5。它可以與多肽和寡糖的氨基發生反應，使得合成過程更簡便、更快速。

圖5氟化乙氧基羰基氯的結構

9-芴基甲氧基羰基是現今多肽固相合成中使用最多的氨基保護基，在它的基礎上，Matsugi等[34]于2006年首次合成了氟化9-芴基甲氧基羰基羟基琥珀酰亞胺酯，結構見圖6。該合成以2,7-二硝基芴為初始原料，将硝基還原為氨基，再經過Heck反應，在2和7号位連上含C4F9或C6F13的氟标簽。2013年，Sugiyama等[35]對此方法進行改進，發明了合成氟化9-芴基甲氧基羰基羟基琥珀酰亞胺酯(f-FMOC)的一鍋法策略。2017年，Matsugi等[36]将f-FMOC試劑作為氨基的保護基和氨基酸結構的編碼标簽，制備了幾種在血管緊張素轉換酶抑制試驗中顯示出高活性的三肽和五肽。

圖6氟化9-芴基甲氧基羰基羟基琥珀酰亞胺酯的結構

由于氟标簽具有極強的疏水性，所有含氟标簽的多肽在親水溶劑中的溶解度都很差，當需要維持生理環境時(例如在磷酸鹽緩沖溶液中)，這種疏水性就限制了氟化合物在生物系統中的應用，并且這種疏水性可能導緻與氟标簽結合的蛋白質聚集。因此，水溶性氟标簽的發現引起了化學家們的關注。2011年，Qian等[37]開發了一種新型的水溶性氟标記試劑——磺基-NHS-(OEG)3-全氟辛烷，其包含磺基-N-羟基琥珀酰亞胺酯基團(作為與多肽或蛋白的氨基部分反應時的離去基團)、酸不穩定的叔氨基甲酸酯基團、低聚乙二醇連接臂以及全氟烷烴鍊C8F17，結構見圖7。其中，将低聚乙二醇作為連接臂，由于其具有很強的極性和親水性，使得經衍生化後的多肽或者蛋白的溶解度出現不同程度的增加，并且能夠有效減少衍生化蛋白質的聚集。為進一步證明磺基-NHS-(OEG)3-全氟辛烷在蛋白質/肽衍生化中的潛力，将其用于衍生化牛血清白蛋白。整個衍生化反應在磷酸鹽緩沖溶液中進行，未觀察到沉澱，這表明衍生化反應可以在水溶液中進行而無需引入任何有機溶劑。

圖7水溶性氟化試劑的結構

以上都是直接與目标産物連接的氟标簽，還有一種氟标簽是作為封端劑來使用的。2004年，Montanari等[38]合成了一種三價氟碘鎓鹽，結構見圖8，在氨基酸脫保護和最後裂解的反應條件下都有很好的穩定性，且一旦遊離氨基被這種試劑烷基化，它們在進一步的多肽偶聯步驟中将不發生反應。實驗結果表明，利用此封端劑合成多肽後，經過FSPE純化，合成過程中産生的缺失序列雜質被完全去除。

除了以上介紹的這些氟标簽，還有一些氟标簽也是連接在氨基處的，但是由于沒有報道将其應用于多肽純化中，而是應用于别種化合物的合成和分析(例如寡糖[39,40]、氨基酸[41])，所以在此處就不予贅述。

圖8三價氟碘鎓鹽的結構

2.2與羧基相連的氟标簽

與氨基相比，連接在羧基上的氟标簽較少。2001年，Pardo等[42]合成了一系列叔丁醇類的氟化試劑——氟化叔丁醇，結構見圖9。這些試劑是由對應的含全氟烷烴鍊的格氏試劑和丙酮或乙酸乙酯反應生成。和叔丁氧羰基類氟化試劑相似，這些氟化試劑含有2條全氟烷烴鍊。

圖9氟化叔丁醇的結構

2006年，Fustero等[43]以2-(三甲基矽烷基)乙醇為模闆，制備了一種新型的氟代醇——氟化2-(三甲基矽烷基)乙醇，結構見圖10。這個氟化試劑的特點在于去除氟化2-(三甲基矽烷基)乙醇基團僅需要溫和的反應條件(四丁基氟化铵)，即能發生酯交換反應，達到去除氟标簽的目的。這使得其在多肽和逆肽的合成中具有重要潛力，即使在易于發生差向異構化的多肽上也是如此。

圖10氟化2-(三甲基矽烷基)乙醇的結構

氟标簽作為輔助純化的工具，對其進行回收和再利用是一種既能降低成本，又能對環境有利的做法，例如在利用氟标簽輔助合成寡糖的過程中，苄基型氟标簽便是一種可回收的氟标簽[44]。然而在多肽合成中，大部分氟标簽的回收存在一定難度，因為在用強酸去除氟标簽的同時，氟标簽會被部分分解。2005年，Goto等[45]合成了能通過簡便方式回收的氟化試劑，它是一個含有6條全氟烷烴鍊的醇，與氨基酸殘基的羧酸基團發生反應而使之帶上氟标簽，結構見圖11。在利用此氟标簽進行多肽合成的過程中，隻需通過在FC72[一種市售的碳氟化合物溶劑，主要由全氟己烷(C6F14)異構體組成]和有機溶劑(例如甲醇或乙腈)之間進行簡單萃取即可直接獲得每個含氟标簽的中間體。最後通過兩步裂解反應：第一步在強酸性條件下将目标多肽切割下來；第二步将FC72層中的氟标簽經過甲醇鈉的處理，實現氟化試劑的回收和重複利用。

圖11可回收氟化試劑的結構

3、特殊肽的富集

3.1硝化肽的富集

硝化肽是在酪氨酸殘基酚羟基的鄰位引入硝基形成的多肽。蛋白質酪氨酸殘基的硝化通常會影響蛋白原本的功能[46]。但是由于蛋白質硝化是一種低豐度的翻譯後修飾，硝化酪氨酸殘基的濃度水平極低，因此開發有效的硝化蛋白質富集方法具有重要意義。目前大多數可用的方法都基于免疫化學富集方法，然後進行質譜分析，然而有效抗體的缺乏限制了蛋白質組學水平上硝化蛋白的研究。

2011年，Kim等[47]開發了基于氟親和力的純化富集硝化肽的方法。該方法通過三步反應，在硝基部分連上氟标簽：(1)乙酰化，此步驟用來保護N末端胺基和賴氨酸殘基的ε-胺結構；(2)還原反應，将硝基還原為伯氨基；(3)氟化，将氟标簽連接至生成的伯氨基處。在衍生化完成後，通過FSPE富集得到帶有氟标簽的硝化肽，質譜結果顯示，反應轉化完全，并且能有效富集硝化肽。

3.2磷酸化肽的富集

磷酸化是活細胞中蛋白質最重要的翻譯後修飾之一[48]，因此選擇性富集磷酸化肽具有極其重要的意義。

2016年，Zhao等[49]首次設計并合成了全氟化的磁性介孔微球(Fe3O4@mSiO2-C8F17)。磷酸化多肽經過β-消除和邁克爾加成反應，生成含有氟标簽的磷酸化多肽。然後，通過Fe3O4@mSiO2-C8F17富集含氟标簽的磷酸化多肽，并與未标記的多肽磁性分離，随後将其洗脫進行質譜檢測。實驗結果顯示，這種全氟化磁性介孔微球具有出色的分散性，對含氟标簽的多肽具有良好的富集能力以及特異性。

不僅如此，這種全氟化的磁性介孔微球還可以通過類似的機制富集經過不同翻譯後修飾的多肽、聚糖[50]和水中的有毒全氟化物質[51]。

3.34-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)修飾肽的富集

細胞蛋白的4-HNE修飾被認為是心血管疾病、神經退行性疾病、糖尿病和腫瘤等多種疾病的病理生理學特征[52]。然而，由于這種修飾的豐度較低，所以需經過富集，才能進行後續分析。傳統的富集方法包括固相酰肼法和生物素-親和素親和力法，但是它們都具有富集過程耗時長、洗脫條件苛刻等缺點。

2017年，Yuan等[53]開發了一種基于氟衍生化和FSPE的新方法來富集4-HNE修飾的多肽。在這種方法中，多肽首先通過4-HNE中的醛基與氟化試劑的氨基氧基之間發生肟點擊化學反應，使多肽連上氟标簽；随後，通過FSPE進行純化和富集。實驗結果表明，這種方法十分快速以及有效，使用這種新穎的方法成功鑒定了432種蛋白質上的661個4-HNE修飾肽上的673個4-HNE修飾位點。

4、總結與展望

基于氟親和原理的FSPE因其高特異性、普适性以及操作的簡便性，得到了很多科學家的關注和研究。本文綜述了多肽氟标簽的種類、FSPE在多肽合成、純化和富集中的應用以及相關技術。這些方法盡可能多地簡化了合成純化步驟，對複雜反應體系中的目标産物進行有效的選擇性富集；并且與多種分析方法兼容，有利于對目标産物的後續分析。FSPE在多肽純化方面的應用還有很大的發展空間，目前應用于多肽純化的氟标簽基本都集中于氨基和羧基上，即使是富集一些特殊肽，也是将其中的特殊基團轉化為氨基之後再進行富集，所以發明更多樣化的氟标簽設計和含氟固定相，以滿足不同反應體系和富集不同翻譯後修飾肽的需求是今後拓展其在多肽領域應用的關鍵。但目前已有的研究結果足以證明這個技術在多肽研究領域的獨特優勢和潛力。

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