做實驗的小夥伴們都知道，與DNA相比，RNA是極其脆弱的。這是由于RNA自身的不穩定性及RNase的穩定存在，極易被分解。一旦降解，後續實驗結果往往不如人意。因此，提取RNA後，我們需要對RNA進行相關的質量檢測，來确定它是否符合後續的實驗要求，如qPCR、Northern分析、cDNA文庫構建以及用于微陣列芯片分析的cDNA标記實驗等。

濃度（純度）檢測

RNA得率有很強的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。那閑話少說，我們來看看下面兩種測定RNA濃度的方法。

01、紫外分光光度計

核酸分子的嘌呤和嘧啶堿基，都具有共轭雙鍵，其能吸收紫外光并在260 nm處具有最大吸收峰。大多數蛋白質含有芳香族氨基酸，這些氨基酸在280 nm處有最大吸收峰。另外一些鹽離子和有機化合物在230 nm處有吸收峰。

圖1.各物質紫外吸收波長

根據這些理化性質，可以用紫外分光光度計的方法檢測核酸濃度。通常以OD260為1相當于40 ng/μL的單鍊RNA，因此RNA樣品濃度（ng/μL）=OD260×稀釋倍數×40 ng/μl。

注意：測量時需先使用溶解RNA的溶液對紫外分光光度計進行校正。

除了RNA濃度，OD260/280和OD260/230還能指示RNA的純度：

注意：溶液pH值會影響OD值的測量，若用純水溶解，溶液呈弱酸性，導緻OD280上升，OD260/280偏低。

02、熒光染料法（Qubit計）

熒光染料可特異的與靶分子（雙鍊DNA、單鍊DNA、RNA或蛋白）結合，在特定波長光源的激發下發出熒光，儀器接收熒光值轉化為濃度值，從而對DNA和RNA進行精準定量。

圖2. Qubit檢測實驗流程

03、兩種濃度檢測方法比較

紫外分光光度計和熒光染料法檢測各有優勢，建議配合使用。紫外分光光度計能指示核酸純度；熒光染料法特異性及靈敏度更高，适于精确定量的下遊實驗以及低濃度的珍貴樣本，如二代測序等。

完整度檢測

01、瓊脂糖凝膠電泳

我們檢測總RNA完整性最常用的方法是采用瓊脂糖凝膠電泳。RNA電泳可以在變性和非變性兩種情況下進行。在非變性條件下，無法準确判斷其分子量；在變性條件下，排除二級結構的影響，RNA的泳動速率與分子量的對數呈線性關系。因此，如需精确測定RNA分子量，需使用變性凝膠，但若為了快速檢測RNA完整性，使用普通的瓊脂糖凝膠即可。

在看電泳圖前，我們需要了解一下沉降系數（S），它是反映生物大分子在離心場中沉降速度的一個指标，值越高，說明分子越大。

圖3.RNA質量較好的電泳圖示例（肝髒）

那好的電泳圖具有哪些特征呢？（如圖3）

（1）從上到下呈現3條rRNA條帶，且上面兩條條帶明亮、清晰、銳利（指條帶的邊緣清晰）：

★ 一般動物樣品有28S、18S、5S——如果提取過程經過過柱處理或者利用CTAB LiCl方法提取，5S可能較暗或者沒有。若是昆蟲或軟體動物等樣本，則隻有1條比較明顯的帶，例如果蠅、牡蛎等。

★ 一般植物樣本有三條帶：25S、18S、5S；

★ 原核生物一般為：23S、16S、5S；

理論上28S:18S為2.7:1，但長期以來人們使用2:1的比率作為鑒定完整RNA的标準。事實上，大多數樣品中提取的RNA幾乎都達不到2：1的比值。以DNA Marker做對照（如圖3），如果2 kb處的28S和0.9 kb處的18S條帶清晰，且28S：18S>1，該完整性可以滿足絕大部分實驗的要求了。

（2）無多餘條帶。雜帶有兩種可能：一是存在DNA污染（圖4），二是組織部位本身含條帶較多（例如含大量葉綠體的樣本，如植物葉片等）

圖4. DNA污染

02、2100檢測

Agilent 2100檢測可通過芯片實驗室微流控技術平台同時對RNA的完整性、純度或降解程度進行精确的、數字化的評估，可以替代傳統的凝膠分析方法。其以峰圖和RIN值（RNA Integrity Number）來指示RNA的完整性。

▶ 2100峰圖：

若核酸完整，則峰圖基線平整；若核酸降解嚴重，則基線不平并出現較多降解峰。

▶ RIN值：

數值大小即反映RNA的完整性，在0-10區間範圍内，數值越大表明RNA質量越好、完整度越高。且RIN值越大，基線越平整、主峰越銳利。一般認為RIN值≥5，說明RNA完整度較為良好，RIN值≥8，說明RNA完整度較為完美。

下圖為典型的真核生物2100檢測峰圖：

圖5.真核生物2100峰圖（HEK293）

典型真核生物2100峰圖中常見有5個峰（圖5），但不是所有真核生物都是這幾個峰。如植物葉片的細胞器也含有核糖體，在18S前的3個小峰為葉綠體RNA（圖6）。

圖6.水稻葉片峰圖

（改自：謝月蘭, 等. 中國農學通報, 2020）

細節決定後續實驗結果的好壞！掌握RNA檢測方法，讓我們的實驗輕松上手！

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