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熒光定量pcr數據分析有哪些方法

科技更新时间:2025-01-01 11:38:27

實時熒光定量PCR數據中的基本概念：

在整個擴增過程中會出現基線期，指數期，線性期和平台期。其中在基線期和指數增長期，擴增産物都是以指數級增長，但是在基線期我們沒辦法檢測；而到了線性期和平台期之後，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差别很大，因此沒有辦法計算模闆的含量。因此，在指數增長期的CT值就成了計算模闆含量的關鍵值。

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▲ 圖一：線性圖譜

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▲ 圖二：對數圖譜

為什麼知道CT值就能夠得到最初的目标基因含量呢？

如圖三，表示一個基因單次擴增曲線。N為擴增産物的分子數，模闆的分子數乘以1 擴增效率的n次方，n代表循環次數。也就是說，如果擴增效率為100%，産物的分子數就等于模闆數乘以2的n次方。但是在線性增長期和平台期，擴增效率不可能是100%，因此PCR理論方程隻在指數期成立，也就是圖三綠色框的部分。

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▲ 圖三

數據處理：

以下三張圖分别表示我們在做熒光定量PCR時提到的三個名稱：擴增曲線、标準曲線、溶解曲線。

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1、絕對定量：使用一系列稀釋的已知濃度的标準品與未知樣本同時進行測定，根據系列濃度标準品的CT值與起始模闆量之間的線性比例關系。

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注意事項：

☑ 标準品必須來源可靠，濃度已知。

☑ 标準品要和待測樣品同時在儀器中擴增。

☑ 隻能根據标準品覆蓋的濃度範圍進行待測樣本濃度的推測。

2、相對定量：是用來确定經過不同處理的樣品之間的表達差異或目标在不同時相差的表達差異，也就是倍數差異。

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