1、包涵體裂解

細胞内重組蛋白的提取要依照蛋白的來源和性質選擇合适的方法，蛋白一般來源于細菌、植物、哺乳動物細胞等。

細胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、勻漿、超聲破碎法、凍融等。

1）細胞酶解：在稀釋菌液中加入2-0.4mg/ml溶菌酶、1mM MgCl2、20ug/ml DNase、1mM PMSF，混均勻，冰上或者室溫放置30min。根據目的蛋白對溫度的敏感性選擇合适的溫度。

2）機械裂解：加入1% Triton X-100，充分混勻，冰上放置15min，在冰上用超聲波破碎細胞10min，至細胞變澄清，或在-20℃下冰凍，室溫溶解，反複凍融5次以上；4℃，5000rpm離心15min，棄上清，用45um或0.22um的濾膜過濾除去細胞碎片。

在細胞裂解時應該注意：

a、盡量選擇比較溫和的處理方法，避免太劇烈地操作導緻目的蛋白變性，或者蛋白酶釋放。

b、為了保持蛋白質的穩定性，在蛋白的提取時應迅速，低溫，添加蛋白酶抑制劑，例如，加入DFP（二異丙基氟磷酸）抑制或者減慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，選擇合适的緩沖溶液穩定蛋白溶液的pH值及離子強度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。

2、包涵體洗滌

包涵體常用的洗滌試劑：中性去垢劑和還原劑。在包涵體表面吸附着大量的不溶性蛋白，内部成分除了含有重組蛋白，還含有RNA聚合酶、外膜蛋白等雜蛋白，DNA、RNA核酸片段，多糖，脂類等。通過包涵體的洗滌能夠除去一些影響重組蛋白活性的雜蛋白，例如，大腸杆菌外膜蛋白OmpT在8 mol/L的尿素中具有蛋白水解酶的活性，可能在包涵體的溶解中降解重組蛋白。

常見的中性去垢劑：Triton X-100，SDS，CTAB，Tween-20，脫氧膽酸鹽等，溶解能力比變性劑更加溫和。

還原劑：0.1-5 mM β-巯基乙醇，二硫蘇糖醇，谷胱甘肽等，對于含有半胱氨酸的重組蛋白，還原劑的使用非常重要。

3、包涵體的溶解

變性劑鹽酸胍/尿素是包涵體溶解常用的試劑，使蛋白質的氫鍵發生可逆性的變性作用，破壞蛋白質的折疊。如4-8的尿素，4-6M的鹽酸胍；變性劑在溶解包涵體蛋白時，必須事先檢測他們和目的蛋白的兼容性，可以利用層析柱法分離溶解蛋白和變性劑，在分離的同時進行純化和複性。

還原劑的濃度、作用時間、溫度、離子強度要影響變性劑的溶解作用，因此在蛋白質變性時可以加入中性去污劑（SDS、CTAB、Tween20等）、還原劑（β-巯基乙醇、DTT、GSH等）。

4、包涵體蛋白複性

溶解後的重組蛋白必須正确的折疊才能複性形成具有功能性的蛋白，去除變性劑是影響蛋白複性的因素之一，另外還需考慮pH值、還原劑的存在，宿主蛋白與重組蛋白之間的濃度比對蛋白複性的影響。

複性的技術有：稀釋蛋白溶液到接近中性、逐步透析去除變性劑、柱上複性、凝膠過濾層析。

蛋白複性之後可根據其他純化蛋白的方法進一步純化蛋白。

5、包涵體蛋白純化

複性以後的蛋白純化方法和可溶性蛋白純化方法相似，即離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析法、硫酸铵鹽析沉澱法等。

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