新型冠狀肺炎爆發以來，學術界、制藥業和大衆都努力尋求有效的應對策略，從尋找藥物到疫苗開發“競速”，各國政府和機構組織、企業在持續不斷加碼；全球積極開展疫苗研發，mRNA疫苗技術平台促進了疫苗的快速開發，mRNA疫苗作為新一代的核酸疫苗也迅速吸引了大衆的目光。

研究表明核酸疫苗在對抗幾種類型的癌症和傳染性病原體方面的有效性，而傳統的疫苗平台可能無法誘導保護性免疫反應，核酸疫苗将減毒活疫苗的免疫學特征(如内源性抗原表達和T細胞誘導)與滅活疫苗或亞單位疫苗(如确定的組成和安全性)結合在一起[1]，在研發生産實效性上核酸疫苗也具有決對的優勢。這些主要歸功于安全有效的體内基因傳遞材料和高質量基因的生産方案的不斷優化。

經過多年的研究，讓制造高質量的“治療性”可高度翻譯且不引起嚴重炎症的核糖核酸這一主要限制在很大程度上通過一些關鍵的創新得到了解決，例如通過摻入了修飾的核苷[4，5](特别是修飾的尿苷)，優化了編碼序列并通過高效液相色譜(HPLC)對IVT mRNA進行了嚴格純化，去除dsRNA殘留；所有這些技術都有助于抑制合成mRNA的免疫應答，從而降低毒性并改善基因的翻譯[2]。

新型修飾核苷酸的合成及其摻入核酸序列為改變核苷酸的化學性質提供了許多可能性，這大大拓寬了核苷酸的實際應用領域。如，mRNA結構的“加帽”在包括翻譯起始、剪接、細胞内轉運等在内的多種細胞過程中起着至關重要的作用。人工合成“加帽類似物”對體外合成的mRNA進行修飾，可提高mRNA的翻譯效率和轉染效率，成為科學研究的重要手段[3]。當核酸疫苗/藥物應用于人體，減少對人的毒副作用是首要的，在mRNA序列合成階段，摻入修飾核苷酸以及在合成的mRNA 5’封端（加“帽”）、3’加Poly（A）均是有效的做法，此前，德國疫苗巨頭CureVac的新冠mRNA疫苗因mRNA合成時沒有使用修飾核苷而導緻毒性較大引起了人們的廣泛熱議。

從化學角度來說，修飾核苷酸是含有一個或多個修飾基團的核苷酸類似物，這些基團可能包括硼酸、甲基、甲氧基、生物素等。核苷酸由3部分組成：堿基、五碳糖、磷酸基團。

核苷酸結構圖

以上的修飾在這3個部分都可以進行，所以根據修飾位置的不同，可以分為：堿基修飾、糖基修飾以及磷酸基修飾。除了這些傳統修飾的核苷酸，還有一些特殊修飾的核苷酸，比如：非核苷5’三磷酸酯、西多福韋二磷酸酯（Cidofovir-Diphosphate）它的五碳糖由閉環變成了開環結構，并且隻含有2個酯鍵。

根據修飾核苷酸修飾位置不同，主要可以分為以下8類：

1、糖基修飾核苷酸

糖基改造修飾的類型包括無環核苷,脫氧核苷,雜原子引入,構型變化,糖環大小的變化等。主要用于鍊終止的2’端的修飾，或者表面/分子連接的氨基的修飾以及點擊化學的2’疊氮基修飾等。

2、堿基修飾核苷酸

常在堿基的位置進行一個甲基化，用于提高Tm值、引入突變、幹細胞研究、mRNA藥物研發、适體設計（SELEX）。mRNA疫苗研發中常進行假尿嘧啶化修飾，尿嘧啶修飾是最豐富的 RNA 修飾，一般由尿苷的異構化産生，已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能：改變密碼子、增強轉錄本穩定性和應激反應應答。

3、磷酸基修飾核苷酸

常見的修飾方法是硫代，硫結合到磷酸基上，或者硼酸基取代磷酸基團，磷酸基修飾核苷酸常通過體外轉錄/PCR摻入目的片段，以獲得抗核酸外切酶的抗性。

4、非核苷5’三磷酸酯

一般用于抗病毒研究，如上文提到的西多福韋二磷酸酯，開環結構，能夠競争性的抑制病毒中的DNA，破壞DNA的延伸，終止DNA合成。

5、雙磷酸酯核苷（5’及3’均含有磷酸基團）

應用場景主要在應激反應，比如饑餓條件下，核苷二磷酸和RNA聚合酶會減少翻譯的合成，并且增加生物合成基因的轉錄，保證保持細胞内氨基酸和脂肪保持在正常水平。

6、标記的單/三磷酸酯

這種修飾在磷酸基團上加了生物素，常用于蛋白互作研究，是核酸和蛋白功能研究中常見的标記物。整體應用場景較多，能在SELEX開發适體中進行目的片段或者靶蛋白的富集，同時，如果上面标有生物素則可用于核酸捕獲/純化，以及示蹤劑标記、免疫測定、核酸檢測等方面。

7、加帽類似物

mRNA體外合成的修飾，在核苷酸的5’磷酸基團上用鳥苷形成5’三磷酸酯骨架的結構，在最近火熱的mRNA疫苗/藥物開發中應用廣泛，5'帽子可以促使 mRNA 和核糖體的結合，能有效地封閉 RNA 5'末端以保護 mRNA 免疫 5'核酸外切酶的降解，增強 mRNA 的穩定性。此外，5'帽子還參加 mRNA 前體的剪接，參與 mRNA 3'末端多聚腺苷酸化，保證mRNA在細胞質中的穩定運輸。

8、5’-3’二核苷酸

是一種存在于生物體内，2個核苷通過5’、3’的磷酸脂鍵連接在一起組成的物質，哺乳動物中的RNA聚合酶可以利用二核苷酸從而引發啟動子的特異性，促進轉錄，啟動DNA複制。

修飾核苷酸已被廣泛應用于醫藥領域(包括此次新冠mRNA疫苗/藥物的合成），目前對假尿嘧啶化修飾和 2'-O - 核糖甲基化修飾位點的定位可以達到單核苷酸的精度。

作為國内一家生命科學領域專業的研發生産公司，諾唯贊能夠提供從模闆的合成、轉錄、加帽、加尾到純化的全套解決方案，助力mRNA疫苗研發與生産。

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