從1985年至今的30多年時間裡，PCR分析經曆了三代技術的發展。第一代傳統PCR技術，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR産物進行定性分析。第二代熒光定量PCR技術，通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信号的積累實時監控PCR進程，最後用Cq值對基因進行定量分析。第三代數字PCR技術，無需标準品即可實現真正的目标核酸的絕對定量，同時提高檢測靈敏度和精密度。

PCR技術在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經滲透到分子生物學領域的各種研究層面。尤其在今年全球大流行疾病中，展現了PCR技術的強大之處。那在科學研究中，我們該如何選擇傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術所有的基礎源于PCR反應的基本原理和PCR反應的3個重要階段，分别是指數期、線性期和平台期。

指數期

指數期内，每個循環PCR産物量大約增加1倍（假定 100%反應效率），該階段的擴增反應具有高度特異性和精确度。

線性期（高變異性）

随着PCR反應體系成分的消耗，其中的一個或者多種成分限制反應，導緻反應開始減緩，并且每個循環的PCR 産物不再加倍。

平台期

反應停止，不再産生更多的産物。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每個反應将在不同的時間點進入平台期，平台期内可以看到這些差異。

傳統 PCR

傳統PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終産物進行分析（圖2），它的局限性就在于隻能做定性分析。在圖3中，3個反應孔含有相同量的 DNA模闆，但到達平台期後産生的熒光信号卻不同，說明擴增産物的量存在不同（反應動力學變化所緻）。這也表明了傳統PCR平台期測量時結果存在變異，産出的DNA量不一定能反映最初情況，所以無法進行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發現在指數期内，3個反應孔的擴增曲線完全重合，說明指數期内進行檢測将更加精确，可實現更加準确的定量。阈值線是擴增産物熒光強度超過背景時的一個熒光強度值，樣品達到此熒光強度值所經過的循環數稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與一系列标準品的Cq值，可以精确測定未知反應中的模闆 DNA數量。

數字 PCR

數字 PCR 是通過将樣本DNA随機分布至獨立的反應單元中，每個反應單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的目标分子，所有獨立的反應單元進行平行擴增後，對每個反應單元的陰性或者陽性熒光信号進行檢測并進行統計學分析，就可以計算出原始樣本的拷貝數，無需參考标準品或内源性對照品，也不需要标準曲線。

傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR的選擇

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參考文獻：

1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.

2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.

3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.

4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.

5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.

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