作者科研體會：文章作者所在課題組曾在該實驗實施前做過一次預實驗，發現1周的造模周期确實會使模型動物膝關節炎症表象明顯，但在後期觀察中發現，其關節積液會随着時間減少，炎症因子檢測較之前降低，與上述研究結果一緻。但在造模過程中，在第12天再次對模型兔進行藥物注射後，可以表現出較為穩定的、貼合臨床的膝骨關節炎滑膜炎模型。研究發現，滑膜受損後易于修複，且可過度增生，同時膝骨關節炎滑膜炎是一種慢性疾病，結合前人研究和實驗，可以合理認為膝骨關節炎滑膜炎的總體病理過程應該是由于膝關節在長期損傷和修複過程中形成的退化性疾病。因此，作者認為穩定的膝骨關節炎滑膜炎模型相應會有一個損傷-修複-再損傷的發病過程。

材料

1 動物管理 6月齡健康雄性清潔級新西蘭大白兔16隻，平均體質量2.0-3.0 kg，購自上海市松江區車墩實驗動物良種場，許可證号：SCXK(滬)2017-0003。所有實驗動物均按照12 h晝夜節律飼養，自由飲食。

2 試劑及儀器 木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)；L-半胱氨酸(北京索萊寶科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛 (合肥蘭傑柯科技有限公司)；蘇木精染液/伊紅染液(無錫江原失業技貿總公司)；腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、前列腺素E2 ELISA試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；離心機(TGL-168，上海安亭科學儀器廠)；數字皮溫器(LG-507，藍格科技有限公司)。

實驗方法

1 分組 動物适應性飼養(溫度20-25 ℃，濕度65%)1周後，采用随機數字表法，将16隻兔分為對照組和模型組，每組8隻。

2 模型制備 造模方案基于以往相關研究并結合作者所在課題組預實驗制定，采用4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液制備膝骨關節炎滑膜炎兔模型，而對照組不進行任何幹預。該方案具體步驟如下：①用10 mL注射器抽取6 mL木瓜蛋白酶溶液和3 mL半胱氨酸溶液，配制成4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液(2∶1)，搖勻後注入10 mL離心管，水浴加熱至常溫。②将模型組兔抓取至兔固定器中，稱質量記錄後，剃去兔右膝關節長毛，并用碘伏進行消毒。用1 mL注射器抽取0.2 mL/kg混合試劑，将兔膝關節屈曲45°，沿髌間窩方向對髌骨下緣髌韌帶外側進針，進針後手下有落空感即可，撤回1 mm後回抽，如無血液倒流則可注入試劑。

以上操作從造模第1天開始執行，分别于造模第1，4，7，12天進行相同操作，給藥時間共計14 d。在模型制備過程中，模型組有1隻實驗兔發生死亡，剩餘動物進行模型評價，其中模型組7隻，對照組8隻。

3 膚溫測試 記錄實驗開始前、實驗第2，5，8，13，15天早9：00對各組兔膝關節進行膝關節膚溫測量。安撫實驗兔使其保持安靜，将數字皮溫器測溫頭置于兔膝關節髌骨處，待溫度不再變化後記錄讀數為兔膝關節膚溫。

4 膝關節MRI 實驗第14天從每組随機選取2隻動物，用10%的水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射以達到深度麻醉效果，将兔雙下肢伸直并用紗布繃帶綁定，兔尾用醫用膠布向背固定，充分暴露雙膝關節後仰卧位行MR檢查。掃描序列：T1WI(TR：11.70 ms，TE：5.17 ms，TA：4:37，voxel size 0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm，Rel.SNR 1.00，Dist factor 20%，Fov read 100 mm，Slice thickness 0.58 mm， phase oversampling 80%，Slice oversampling 57.1%，Slices per slab 56，Averages 2，Concatenations 1，Coil elements 15K)、T2WI(TR：15.50 ms，TE：5.10 ms，TA：4:33，voxel size 0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm，Rel.SNR 1.00，Dist factor 20%，Fov read 100 mm，Slice thickness 0.6 mm，phase oversampling 70%，Slice oversampling 6.7%，Slices per slab 60，Averages 2，Concatenations 1，Coil elements 15K)。觀察關節積液及軟骨情況，由專業影像學技術人員對MRI圖像進行解析。

5 麻醉與取材 實驗第15天用10%水合氯醛按3.5 mL/kg對實驗兔進行腹腔麻醉後(建議先給總量的2/3，觀察兔的反應再給剩餘量)。抽取兔右膝關節滑液，觀察關節液的顔色、黏稠度等大體情況，然後将關節液放入冷凍管中，-80 ℃保存。剪斷股四頭肌腱，沿髌骨内外兩側縱行剪開關節囊，将髌骨及髌韌帶向下翻，觀察髌上囊及脂肪墊上的滑膜色澤。眼科剪緊貼脂肪層剪下滑膜，PBS洗淨，放入40 g/L多聚甲醛中，在4 ℃環境下保存。

6 蘇木精-伊紅染色觀察 将兔膝關節滑膜組織放入包埋盒中，進行PBS沖洗、常規梯度乙醇脫水、透明，随後将組織放入熔化的石蠟中進行浸蠟和包埋，5 μm厚連續切片。将切片分别作蘇木精-伊紅染色後，用普通光學顯微鏡觀察。

7 ELISA 取出試劑盒，嚴格按照說明書方法進行加樣、加酶标溶液、溫育、洗闆、顯色操作，在450 nm波長下讀取酶标闆各孔的吸光度值，同時用軟件Ascent software for Multiskan對吸光度值進行分析，計算出滑液中腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、前列腺素E2的質量濃度。

1.5 主要觀察指标 ①兔膝關節表面觀察；②形态學觀察：影像學、組織學；③分子水平：腫瘤壞死因子α、白細胞介素β、前列腺素E2。

1.6 統計學分析 應用SPSS 23.0軟件處理數據，所有計量資料以x±s表示，并對所有計量資料進行正态性檢驗及方差齊性檢驗。符合正态檢驗的組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正态分布組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。此次研究中，所有結果均采用獨立樣本t檢驗進行統計，P < 0.05表示差異有顯著性意義。

信息來源：中國組織工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3738-3743.

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