課題組師兄的步伐學習如何做負染。

負染色法（Negative stain）是一種染色方法，常用于不透光液體标本的鏡檢。由于其染色處理過程并非針對菌體本身，故又稱“襯托染色法”、“間接染色法”。在負染色法中，标本不需要熱固定，細胞不會因為化學藥物的影響而變形，對于不易染色的細菌或病毒也能觀察。

負染色是一種容易，快速，定性的方法，常用于檢查分離的細胞器，大分子和病毒在EM水平的結構。但是，該方法不能夠對樣品進行高分辨率檢測 - 這在技術上更為複雜的快速冷凍。另外，因為負染色涉及沉積重原子，容易造成結構假象，球形或圓柱形結構的假象是非常常見的。然而，負染非常有用，不需要過于昂貴的技術。

小編自己拍攝的負染結果

樣品應懸浮在合适的緩沖液（如10 mM HEPES或PIPES）中，1％乙酸铵或蒸餾水中。 最好不要使用磷酸鹽緩沖液或PBS，因為它們可能會污染網格，否則會導緻染色後必須清洗的鹽殘留物，造成襯度的損失。 尤其是，鈾酰鹽與磷酸根離子發生反應，産生細微的結晶沉澱，使沉澱物變得模糊。 [鈾離子的沉澱磷酸根離子也是在使用TEM的樣品處理過程中使用乙酸鈾酰作的潛在問題。】

MRC實驗室Protocol：

所需材料

5％乙酸鈾酯在二水合物中

碳塗層電鍍網格

自鎖/鎖定鑷子

100ul PCR管

發光放電器

清潔玻璃片和培養皿

Whatman紙，石蠟膜

相同緩沖液中的蛋白質和脂質體

準備蛋白質，緩沖液，管和網格。将網格放置在清潔的顯微鏡載玻片上。在實驗室工作台上貼下幹淨的石蠟膜;将任何一面浸濕紙（盡量減少幹燥）。

在PCR管中混合蛋白質和脂質。總體積将取決于您必須使用多少蛋白質。通常我混合至少20 ul;否則蒸發會大大改變鹽含量。

輝光放電：在真空室内放置帶有栅格的頂部（碳朝上），并拉動真空和輝光放電。如果不使用自動定時器，輝光放電30-60秒。排空後，将其置于培養皿中并返回實驗室。如果沒有可用的發光放電器，則可以省略此步驟。然而，結果不會那麼幹淨（較少的蛋白質會綁定，也可能更多地在網格上）。

将UrAc（每次20-40μl）滴入Parafilm - 每個樣品兩滴。在染色方案中，有一塊（折疊）Whatman紙用于吸收多餘的污漬和洗滌網格緩沖液。還有另一塊Whatman，标有貼在其上的染色網格。

在夾鉗中握住網格。将6ul蛋白質/脂質溶液移至網格上。 20-45秒後，将緩沖液蛋白溶液印迹到Whatman紙上，接觸第一次UrAc滴，立即去除多餘的污漬，接觸第二次UrAc滴。等待10-30秒，然後去除UrAc（注意吸除鑷子中殘留的液體）。然後可以通過接觸一滴緩沖液來清洗網格，并将其過量吸收。将網格放在标簽的Whatman紙上

允許網格幹燥幾分鐘，然後放在網格框（注釋位置/ ID在實驗室書）。網格可以立即可視化，通常可以穩定數月或數年。

背景/評論

負染是一種非常快速，簡便的方法，可視化蛋白質，脂質，DNA - 任何大分子複合物。對于較大的蛋白質，複合物或連續寡聚體（例如肽或澱粉樣蛋白纖維，盡管單個亞基非常小，可以容易地可視化）是有用的。理論上最大分辨率的負染色為7A 這幾乎和cryo-EM一樣好，而且要容易得多。更典型的分辨率是15-30A通常有可能可視化數百kD的複合物（NB：簡單的計算和經驗表明，不可能看到單獨的蛋白質，或者在我手中，GroEL 14mers（840kD）或網格蛋白三糖（600kD）小于200kD的複合物，可以在良好的網格上制作，但HSP60單體不能）。然而，負染色的主要缺點是蛋白質固定在低pH，高離子強度的乳液或鈾離子層中。這并不一定會對所有的蛋白質産生重大的瑕疵（對于那些已經被cryoEM和負染所觀察到的那些蛋白質，幾乎沒有假象），但是基本上對蛋白質的影響是未知的。脂質體或脂質管傾向于塌陷，可能來自幹燥期間的高離子強度。

UrAc的替代染色劑是磷酸鎢酸或PTA。這可以在diH2O中達到2％，然後pH值達到7.PTA的優點是pH值更為生理，對于某些事物，分辨率可能更大;缺點是對比度較低，我經常遇到大染色水晶的問題，因此很難找到網格的染色區域。但它是一個很好的控制。如果結構在PTA和UrAc兩者中看起來相同，那麼它們不太可能是染色僞像。

操作方法：

滴染法：一般現将樣品用拉長的毛細吸管一滴在被膜的載網上，用濾紙在載網上吸去多餘的樣品，使樣品在載網上僅有一層水膜而無液滴存在。在水膜未幹時，再加一滴複染液在銅網上，然後用濾紙靠在載網變上吸去多餘的染液，這是常規的負染方法。由于病毒在液滴的邊緣分布較多，上訴方法可能造成較多的病毒丢失，改良的方法是用毛細管在載網中部加1-1.5mm直徑的一小滴病毒懸液。不用濾紙吸幹而任其在自然狀态下稍幹後加入一小滴染液，也不用濾紙吸幹，令其自然趕走。染液的密度取決于液滴的量和它的濃度，應經試驗确定，此法對于一些濃度低的病毒樣品可能獲得較好的效果。

漂浮法：現将需負染的樣品滴幾滴在幹淨的載玻片上，再将有支持膜的載網漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸幹樣品餘液使樣品在載網上僅有一薄層液膜，在樣品未幹時即加一滴複染液的銅網上，用濾紙吸幹多餘的染液即可。也可在磷鎢酸染液液滴中加入少許提純的病毒混勻，講有膜的銅網漂浮在液面上沾取有病毒的染液，用濾紙靠在銅網吸幹。 噴霧法：将樣品與染液混合，用特制的噴霧器将混合液噴灑在有膜的載網上。這種方法的優點是樣品在載網上的分布十分均勻，但需要特殊的設備，故較少采用。而且染液和樣品消耗量較大，又易造成病毒的擴散。負染的時機十分重要，一般不應再載網上的樣品完全幹了之後，也不應該在載網上尚有肉眼可見的水珠時着手染色。應該在用濾紙吸幹載網上的樣品液滴，肉眼看不見殘液，又未幹燥時滴加染液。提純的病毒在負染時最好進行1:10-1:100倍的稀釋，炫富病毒的緩沖液應盡可能稀一些，叫弄的緩沖液會使載網上産生許多鹽類的結晶而影響圖像的質量。緩沖液較濃時，宜先用雙争輝稀釋。複燃用的載網支持膜（有時是碳膜），有時因疏水性的影響沾樣後會形成一個球形液珠，用濾紙一吸即全部吸光，樣品難以附着在支持膜上，遇到這種情況，需要離子濺射儀對載網進行沁水處理，改善支持膜的親水性複燃中常遇到顆粒懸滴樣品的凝集現象，即生物樣品與染色劑形成電子緻密的團塊，緻使無法觀察超微結構。這種現象是由多種因素引起的，除了上訴支持膜疏水性影響外，還可能是懸液濃度過大，懸液中細胞碎片過多，懸液PH值不适等，可以通過對樣品稀釋，驚醒2000-5000rpm離心和調節懸液PH值到中興或偏酸性來解決。懸液顆粒分散性差也可以用分散劑來加以解決用0.005-0.05%牛血清白蛋白（BSA）加入提純的病毒中，加入量無嚴格規定，一般0.5ml樣品中加3-4滴即可，如效果不好可适當怎額增加，也可直接用0.01%BSA作為離心沉澱物的懸浮液。将杆菌肽粉末按30-50ug/ml的濃度用蒸餾水配成溶液，用來稀釋離心沉澱的顆粒标本或按适當比例加到需負染的樣品中取，也可以按樣品，磷鎢酸和杆菌肽等量混合在滴到載網上，吸幹即可觀察。除上訴兩種分散劑外，還有人采用甘油丙二醇作為分散劑，也有人用1%二甲基亞砜（DMSO）加到染液裡加強染液的穿透力和擴散作用，最近有人用十八(碳）烷的單分子層作為濕潤劑，使不易染色的某些生物大恩自以着色。某些病毒對複染色液較為敏感，負染色液會破壞形态結構，遇到這種情況，除改用其它種類的複染色液之外，還可在負染先用1%的戊二醛按比例與樣品懸液混合，固定15分鐘。或者在沾樣後，将載網票在0.1%的戊二醛液滴上進行固定。也可以用四氧化e整齊xun蒸固定然後在做負染。滴樣後用雙蒸水進行适當清洗，可以有效地改善負染效果。尤其是使用醋酸鈾做負染色液時，應盡量洗掉樣品中的緩沖液鹽、組織汁液等，以免與負染液反應産生沉澱。經固定後的樣品必須經過清晰，對直接取自蔗糖密度梯度或氯化铯密度梯度離心沉澱帶的炫富樣品，沾取後雙蒸水适當清洗後，就可直接負染觀察。觀察負染色的生物樣品時，電鏡應使用最小的武警光瀾，以增大反差。加速電壓可稍高一些，也增加電子的穿透能力。盡量避免電子束的長時間照射，一般在 3-4萬倍的放大倍率下照像，均可獲得高分辨率的電鏡圖像。

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