文 / 利刃君

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高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）是色譜法的一個重要分支，應用範圍十分廣泛，對樣品的适用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80%則需用高效液相色譜來分析。HPLC具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點且不能氣化的熱不穩定生理活性物質的特點，已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術應用。

--壹--

色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationphase)發生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滞留時間不同，從而先後從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

高效液相色譜法以經典的液相色譜為基礎，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，将具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有顆粒極細的高效固定相的色譜柱，在柱内各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。

圖1.高效液相色譜儀分析流程

--貳--

HPLC 系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。此外，還可根據需要配置梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC 儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC 儀還備有自動餾分收集裝置。

圖2.高效液相色譜儀的系統組成

輸液泵是HPLC 系統中最重要的部件之一。輸液泵按照輸出液恒定的因素分為恒壓泵和恒流泵，泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。

輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往複泵、雙活塞往複泵和往複式隔膜泵。

表1.幾種高壓性能泵的性能比較

HPLC使用的輸液泵應滿足下列條件：

①流量穩定，其RSD 應＜0.5%，這對定性定量的準确性至關重要；

②流量範圍寬，分析型應在0.1~10ml/min 範圍内連續可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300kg/cm2；

④液缸容積小；

⑤密封性能好，耐腐蝕。

（1）往複式柱塞泵

活塞向外移動時，泵頭出口單向閥關閉，同時流動相進入的入口單向閥打開，溶液（流動相）抽入活塞缸。當柱塞推入缸體時，入口單向閥關閉，出口單向閥打開，流動相被壓出活塞缸，流向色譜柱。雙活塞往複泵的輸液流量比單活塞泵小得多。其優點是不必使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗，但缺點是設備成本較高，流量調節也比單活塞泵複雜。往複式柱塞泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響，連續供給恒定體積的流動相。

圖3.單活塞往複式柱塞泵的構造（A）和雙活塞往複式柱塞泵構造（a）及排液特性（b）

（2）隔膜型往複泵

隔膜型往複泵也是一種恒流泵，活塞與油接觸，當活塞往複運動時，隔膜受到油壓的作用，對流動相部分産生"吸引"或"推壓"，使流動相部分的單向閥吸液或排液，從而獲得穩定的液流。隔膜泵的活塞不直接與流動相接觸，故不存在活塞密封墊磨損對流動相的污染。隔膜泵的死體積小（約0.1mL），因此，更換流動相後平衡快，有利于梯度洗脫。但隔膜泵結構比較複雜，價格較貴。

圖4.隔膜型往複泵結構示意圖

（3）氣動放大泵

氣動放大泵是一種恒壓泵。泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞杆。單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成，在壓力的作用下寶石球離開閥座，流動相流過單向閥；反之，在反向力的作用下，寶石球回到閥座上，此時流動相不再流過單向閥。

流動相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進入檢測器後會在色譜圖上出現尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集後會變成大氣泡，大氣泡進入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現流速不穩定，緻使基線起伏。氣泡一旦進入色譜柱，排出這些氣泡則很費時間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發生變化。

目前，液相色譜流動相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。

超聲波振蕩脫氣： 将配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10-20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。

惰性氣體鼓泡吹掃脫氣：将氣源（鋼瓶）中的氣體（氦氣）緩慢而均勻地通入儲液罐中的流動相中，氦氣分子将其它氣體分子置換和頂替出去，而它本身在溶劑中的溶解度又很小，微量氦氣所形成的小氣泡對檢測無影響。

真空脫氣裝置： 将流動相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時，膜外側被減壓，分子量小的氧氣、氮氣、二氧化碳就會從膜内進入膜外而被脫除。

圖5.真空在線脫氣裝置示意圖

HPLC 有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期内流動相組成保持恒定，适合于組分數目較少，性質差别不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期内程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH 值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的複雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上進行梯度洗脫。

• 線性梯度： 在某一段時間内連續而均勻增加流動相強度。
• 階梯梯度： 直接從某一低強度的流動相改變為另一較高強度的流動相。

梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（内梯度）。

高壓梯度一般隻用于二元梯度，即用兩個高壓泵分别按設定的比例輸送A和B兩種流動相至混合器。具有精度高，易于實現自動化控制的優點。

圖6.高壓梯度裝置結構示意圖

低壓梯度隻需一個高壓泵，與等度洗脫輸液系統相比，就是在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置。

圖7.四元低壓系統結構示意圖

早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重複性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。

一般HPLC 分析常用六通進樣閥，六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。

①部分裝液法進樣：進樣量應不大于定量環體積的50%（最多75％），并要求每次進樣體積準确、相同。此法進樣的準确度和重複性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易産生由進樣引起的峰展寬。

②完全裝液法進樣：進樣量應不小于定量環體積的5~10 倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環内的流動相，消除管壁效應，确保進樣的準确度及重複性。

圖8.六通進樣閥構造原理示意圖

分離系統包括色譜柱、保護柱以及柱溫箱。

色譜柱：色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心髒。色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩闆（濾片）、接頭、螺絲等組成。色譜填料為經過制備處理後，用于填充色譜柱的物質顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：

①常規分析柱（常量柱），内徑2~5mm（常用4.6mm，國内有4mm 和5mm），柱長10~30cm；

②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），内徑1~2mm，柱長10~20cm；

③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），内徑0.2~0.5mm；

④半制備柱，内徑＞5mm；

⑤實驗室制備柱，内徑20~40mm，柱長10~30cm；

⑥生産制備柱：内徑可達幾十厘米。

圖9.色譜柱結構示意圖

保護柱：保護柱的作用主要是防止吸附性強的雜質對色譜柱污染，從而延長色譜柱的壽命。針對不同型号的色譜柱，應選擇相對應填料的保護柱。應注意柱芯也是有壽命的，應該定期進行更換。

柱溫箱：維持色譜柱溫度的恒定，以免造成保留時間的變化，保證分離效果的穩定性。

檢測器是用來連續監測經色譜柱分離後的流出物的組成和含量變化的裝置，是HPLC 儀的三大關鍵部件之一。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性範圍寬、重複性好和适用範圍廣。

表2.HPLC常用檢測器的基本特性

該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正确開展。

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